不同添加物对小花棘豆内生真菌酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1合成苦马豆素的影响

萨如拉,席领军,卢 萍,高 峰,杜 玲

(内蒙古师范大学生命科学与技术学院,中国内蒙古自治区呼和浩特010022)

小花棘豆(Oxytropis glabra DC.)是豆科(Leguminosae sp.)棘豆属(glabra DC.)多年生草本植物,主要生长于盐渍化低湿草甸草原[1]。Colegate等[2]首次从灰苦马豆(Swainsona canescens)中分离出苦马豆素(swainsonine,SW),其分子式是C8H15NO3,相对分子质量为173,可抑制动物细胞甘露糖苷酶的活性,引起低聚糖代谢和糖蛋白合成障碍,导致细胞和组织器官功能紊乱。国际上将含SW的棘豆属和黄芪属植物称为疯草,小花棘豆属于疯草的一种。家畜过量采食含SW的疯草会发生中毒,出现四肢麻痹、不孕、不育、流产等现象,严重者甚至会死亡,给畜牧业带来巨大经济损失[3,4]。然而SW具有良好的抗肿瘤活性和免疫调节活性。刘柄亚等[5]用SW开展人胃癌生长及转移的抑制实验证明其具有肿瘤抑制作用。Goss等[6]将SW用于临床试验,发现SW对肿瘤患者的治疗有效。此外,相关研究指出SW也可用于白血病、喉癌、食管癌、肺癌及胃癌等的治疗[7～11]。SW的分子结构为双杂环,有4个手性构型,在人工合成过程中易形成手性异构体,难以区分,故人工合成SW价格昂贵,而利用生物体(植物、真菌等)自身合成SW,可显著提高合成效率[12,13]。

Braun等[14]首次从美国3种疯草绢毛棘豆(Oxytropis sericea)、密柔毛黄芪(Astragalus mollisimus)和兰伯氏棘豆(Oxytropis lambertii)中分离到产SW的内生真菌,将其鉴定为Embellisia,之后有学者将其修订为Undifilum[15],而后又有学者将其归于Alternaria属,命名为Undifilum oxytropis[16]。卢萍等[17,18]从小花棘豆体外培养出内生真菌,发现其合成了SW,经形态学与DNA鉴定将其归到Embellisia属。目前小花棘豆内生真菌被修订为Alternaria oxytropis,有该内生真菌的小花棘豆产SW,无该内生真菌的小花棘豆则检测不到SW。

Mukherjee等[19]提出在 Undifilum oxytropis中SW合成代谢的部分途径可能为：由α-氨基己二酸可生成赖氨酸和SW(图1),在该代谢途径中具体细节尚未清楚。

近期Ren等[20]通过基因组学研究,推测在Undifilum oxytropis内生真菌中由赖氨酸合成SW可能存在P2C和P6C两种途径(图2)。由于这两条途径是通过基因组学研究推测的,具体细节及参加反应的酶尚不完全清楚。

图1 Undifilum oxytropis中SW合成途径[19]Fig.1 SW synthesis pathway in Undifilum oxytropis[19]

图2 Alternariasect.Undifilumoxytropis中SW合成途径[20]Fig.2 SW synthesis pathway in Alternaria sect.Undifilum oxytropis[20]

本课题组前期已经克隆到小花棘豆内生真菌酵母氨酸还原酶cDNA(KJ944635)和基因(KY-052048),构建了基因缺失载体,并将载体转化至OW7.8原生质体中再生,筛选到酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1。现以酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1和野生株OW7.8为研究对象,通过在培养基中添加酵母氨酸、α-氨基己二酸、赖氨酸和哌啶酸等前体物,比较不同培养时间下内生真菌野生株和突变株中SW合成动态变化,探索酵母氨酸还原酶基因对SW合成动态的影响,为研究酵母氨酸还原酶基因对小花棘豆内生真菌中SW合成代谢途径的影响提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

OW7.8和M1由本实验室提供。SW标准品(纯度≥98%)购自西北农林科技大学,酵母氨酸、α-氨基己二酸、赖氨酸、哌啶酸、乙酸铵产自美国Sigma公司,树脂产自Alfa Aesar公司,琼脂产自Coolaber公司,蔗糖、乙酸、氨水产自天津市化学试剂三厂,色谱纯甲醇产自天津市光复精细化工研究所。

1.2 培养基配制

对照组培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基,PDA)：称取200 g马铃薯,切成小块放入烧杯,加超纯水至1 000 mL,煮沸20 min,用4层纱布过滤除去马铃薯残渣,加入20 g蔗糖搅拌溶解,加超纯水至1 000 mL,分装至锥形瓶,分别加入质量浓度为1.5%的琼脂,121℃湿温高压灭菌20 min。

实验组培养基：在上述PDA培养基中添加酵母氨酸、α-氨基己二酸、L-赖氨酸和哌啶酸溶液。课题组前期研究中在培养基中添加化合物终浓度为1×10-4μg/mL时,内生真菌SW含量最高,故本研究选择了该浓度。

1.3 内生真菌培养及SW提取

将野生型菌株OW7.8和酵母氨酸还原酶基因缺失菌株M1接种至PDA培养基活化,分别用打孔器切成菌饼,接种于对照组和实验组培养基上,于25℃恒温培养。培养至第14 d后每隔3 d取一次样,直至第38 d,烘干称重。每组做3个重复实验。

参照李莎等[8]的方法提取SW：将以上样品置研钵加液氮研磨,转入灭菌离心管中,加乙酸和氯仿,置机械旋转仪80 r/min提取12 h。将提取液离心,抽取上清液至提取管,于80 r/min旋转提取20 min。重复上述步骤。提取管加无菌超纯水颠倒混匀,洗涤阳离子交换树脂,弃去溶液,重复两次。提取管中加氨水,80 r/min旋转混匀20 min,使树脂上的SW溶于氨水中,收集提取管液体,置真空离心浓缩仪浓缩至粉末状备用。

1.4 内生真菌中SW含量检测

高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)条件：以5%(V/V)甲醇和20 mmol/L乙酸铵溶液为流动相(用灭菌超纯水配制),流速为0.4 mL/min,C18柱洗脱,检测母离子数为156,子离子数为70,collision energy=119,CE=30,进样量为 2 μL,柱温为30℃。

SW标准曲线的绘制：称取SW标准品,用灭菌超纯水配制浓度分别为 4.95 μg/mL、2.47 μg/mL、1.24 μg/mL、0.62 μg/mL、0.31 μg/mL 的溶液,按浓度由低至高依次进样,利用HPLC-MS技术检测,用Agilent Mass Hunter定量分析软件对检测结果进行分析,以SW浓度为横坐标、液相色谱265 nm处吸收峰响应值×103为纵坐标得出标准曲线。

内生真菌中SW含量的检测：在上述样品中加入1 mL灭菌超纯水,用0.22 μm针筒式滤膜过滤器过滤除菌,利用HPLC-MS技术对样品进行检测,用Agilent Mass Hunter定量分析软件对检测结果进行分析。

1.5 统计学分析

利用SPSS 21.0软件对同一天不同处理的真菌SW含量进行单因素方差分析及差异显著性分析,其中根据处理间方差是否具有齐性,用Duncan或Tamhane’s T2方法进行多重比较。

2 结果分析

2.1 绘制标准曲线

标准曲线方程为y=1 239.118 81x-155.677 276,其相关系数为R2=0.997 98,线性关系良好(图3),仪器稳定可用于后续样品中SW含量检测。SW标准品在高效液相色谱中峰值为0.869 min,在高效液相色谱里以0.586～1.609 min的保留时间被洗脱。

2.2 内生真菌SW合成的动态变化

在对照组中,OW7.8中SW含量明显高于M1,且在不同时间点OW7.8和M1内SW含量不同,呈先升高后下降趋势。OW7.8中SW含量在第14 d时为 0.733 mg/g,第 14～26 d 缓慢增加,第26～29 d迅速上升,在第29 d达到最高值1.717 mg/g,第29～32 d迅速下降,之后逐渐降低至0.425 mg/g;M1中SW含量第14 d时为0.010 mg/g,第14～20 d增加缓慢,第20～23 d迅速上升,在第23 d时达到最高值0.204 mg/g,第23～32 d逐渐降低至0.020 5 mg/g(图4)。

图3 SW标准曲线Fig.3 The standard curve of SW content

图4 对照组野生型菌株OW7.8和突变株M1内SW合成动态变化Fig.4 Dynamic changes of SW synthesis in the CK groups of wild type OW7.8 and mutant M1

培养基内添加不同化合物对野生株OW7.8内SW合成动态变化均有不同的影响,添加酵母氨酸、α-氨基己二酸、赖氨酸和哌啶酸后,在第14 d真菌SW含量分别为0.756 mg/g、0.137 mg/g、0.003 mg/g和0.112 mg/g,14 d后均出现SW含量上升。其中,添加酵母氨酸后,在第26 d真菌SW含量达最高值1.174 mg/g;添加α-氨基己二酸后,在第26 d达最高值5.819 mg/g;添加赖氨酸后,在第23 d达最高值7.387 mg/g;而添加哌啶酸后,在第32 d达最高值19.547 mg/g,明显高于其他3组(图5、表1)。以上结果提示哌啶酸的影响最大。

以添加化合物为自变量、OW7.8中SW合成量最高值为因变量,进行单因素方差分析,结果显示添加化合物对OW7.8的SW合成有显著影响(P＜0.01)。

图5 添加不同化合物后野生型菌株OW7.8的SW含量动态变化Fig.5 Dynamic changes of SW synthesis in wild type OW7.8 groups with different precursor addition

在培养基内添加不同化合物对M1内SW合成动态变化也均有不同的影响,哌啶酸和赖氨酸的影响比酵母氨酸和α-氨基己二酸大。添加酵母氨酸、α-氨基己二酸、赖氨酸和哌啶酸后突变株M1内SW含量在第14 d时分别为1.096 mg/g、0.333 mg/g、2.405 mg/g、0.028 mg/g,之后均上升。其中,添加酵母氨酸后在第20 d达最高值1.256 mg/g;添加α-氨基己二酸后,在第17 d达最高值0.408 mg/g;而添加赖氨酸和哌啶酸后,分别在第20 d、26 d达最高值7.979 mg/g和8.837 mg/g,最高值明显高于其他实验组和对照组(图6、表1)。

以添加化合物为自变量、M1中SW合成量最高值为因变量,进行单因素方差分析,结果显示添加化合物对M1的SW合成有显著影响(P＜0.01)。

图6 添加不同化合物后酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1内SW含量动态变化Fig.6 Dynamic changes of SW synthesis in mutant M1 groups with different precursor addition

在培养基中添加不同前体化合物均对OW7.8、M1的SW合成变化有不同影响。添加酵母氨酸后,OW7.8和M1内SW含量在第14～20 d均处于上升期,第20 d时M1中SW含量达最高值,而OW7.8中SW含量继续上升,第23 d后OW7.8内SW含量均高于M1;添加哌啶酸后,在前23 d OW7.8内SW含量低于M1,而从第23 d开始进入快速上升期,其后SW含量均高于M1;添加赖氨酸后,OW7.8和M1内SW含量在第14～20 d均处于上升期,而在第20～23 d OW7.8内SW含量进入快速上升期、M1内SW含量则进入快速下降期,第23 d后OW7.8内SW含量均高于M1;添加α-氨基己二酸后,OW7.8内SW含量基本均高于 M1(图7、表 1)。

表1 添加不同化合物后野生型菌株OW7.8和突变株M1内SW含量(mg·g-1)Table1 Contents of SW in wild type OW7.8 and mutant M1(mg·g-1)

取内生真菌SW含量最高值,以2菌株(基因型)和添加化合物为自变量,内生真菌中SW合成量为因变量,2个因素不同水平(菌株2个水平、添加化合物4个水平)进行多因素方差分析,结果显示菌株(基因型)、添加化合物对内生真菌SW合成有显著影响(P＜0.01)。

3 讨论

本研究发现,野生株OW7.8的SW含量高于突变株M1。推测赖氨酸是生物必需氨基酸,酵母氨酸是赖氨酸合成的前体物,敲除酵母氨酸还原酶基因后M1内酵母氨酸合成受阻,需从逆反应方向由P6C转化成酵母氨酸,P6C是SW的前体物,因而M1中SW含量减少。酵母氨酸、赖氨酸、哌啶酸和α-氨基己二酸是内生真菌合成SW的前体物,培养基中添加前体,OW7.8和M1的SW合成量高于对照,说明4种前体物均可促进SW合成,其中哌啶酸较其他前体物促进作用更强,推测哌啶酸是SW合成的直接前体,故对合成量影响大。

酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1是赖氨酸合成缺陷型,添加赖氨酸后不仅满足了真菌对赖氨酸的基本需求,而且其余的赖氨酸可用来合成SW,故赖氨酸的添加对突变株中SW含量变化的影响比野生型大;酵母氨酸是赖氨酸合成的前体,对野生株和突变株添加酵母氨酸一方面可满足真菌合成赖氨酸的基本需求,另一方面多余的酵母氨酸可在酵母氨酸氧化酶的作用下生成P6C,而P6C是SW合成的前体,使OW7.8和M1的SW合成量增加。

杨国栋[21]发现在培养基中添加L-赖氨酸和L-哌啶酸均可促进SW合成,与本研究结果相同。Mukherjee等[19]提出酵母氨酸还原酶基因影响Undifilum oxytropis内生真菌SW的合成,但基因敲除突变株的酵母氨酸和赖氨酸含量减少,SW和P6C含量增加,与本研究结果不尽相同。由于本研究结果是基于内生真菌SW合成的动态变化得出的,推测Mukherjee等的结果可能只反映了真菌生长特定时刻SW合成的情况。

图7 添加不同化合物后野生型菌株OW7.8和突变株M1中SW含量动态变化Fig.7 Dynamic changes of SW synthesis in wild type OW7.8 and mutant M1

本研究结果为研究内生真菌酵母氨酸还原酶基因对SW合成的影响奠定了基础,对合理利用小花棘豆以及在医药领域利用SW有重要意义。