猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR鉴别

姜子义，李 碧，蔡 瑶，颜久淇，龚双燕，樊 毅，黄剑波，朱 玲,2，徐志文,2

(1.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；2.四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130)

猪伪狂犬病毒( Pseudorabiesvirus, PRV )属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科，可感染多种动物，其中猪是最敏感、唯一的自然宿主，常呈流行性感染[1-3]。2012年以来，猪伪狂犬病毒变异株在华东、华中、东北、西南和华北地区呈爆发态势[4]，给养猪业造成了极大的经济损失。PRV gE抗体阳性率从2012年的11.5%上升到了2014年的64.3%[5]，2015-2017年依然保持非常高的阳性率，通过分离毒株测序对比发现爆发地区都是新变异的野毒株感染。

免疫猪群再次发病，阴性猪场重新转阳性是近年来猪伪狂犬病大流行的最主要特征[6]，猪伪狂犬病防控面临着巨大的挑战。上世纪末中国开始使用gE缺失的Bartha-K61(gE-)疫苗[7]，近年中国自主研发的基因缺失株SA215(gE-gI-TK-)使用相当广泛，对经典毒株有非常好的防控力[8]。很多研究者报道现有疫苗对近年来变异毒株侵染缺乏保护力，血清阴性重新转阳性[8-9]，在绵羊攻毒保护模型中对新流行变异毒株侵染的保护不到50%[10]。在未有针对新变异毒株疫苗的情况下，快速区分野毒株和疫苗株成为目前防控猪伪狂犬病疫情的当务之急。

本研究旨在建立一种快速、稳定和有效的多重PCR检测方法，快速鉴别发病猪感染的变异野毒株和之前接种的疫苗种类，从而采取不同的紧急措施防控猪伪狂犬病疫情。

1 材料与方法

1.1 疫苗和病毒

PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)、PRV变异株(2014年分离的XJ株)、猪圆环Ⅱ型病毒(PCV-2)、细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、T3256质粒(TK基因缺失阳性对照质粒)、PP63质粒(gE基因缺失阳性对照质粒)均由四川农业大学动物生物技术中心保存提供。

1.2 细胞与试剂

Vero细胞购自武汉典型物保藏中心。HSTaqDNA聚合酶、dNTPs、2×GC Buffer Ⅱ、DL1000TMMaker均购置于大连宝成生物工程有限公司。

1.3 gE、gB和TK基因核苷酸序列分析

参照文献[11]和[12]中的引物进行gE、gB及TK全基因扩增和测序。利用NCBI进行BLAST对比分析，发现PRV-XJ、PRV-JJ、PRV-MS和PRV-YA新分离株gE基因扩增核苷酸序列与国内野毒株核苷酸序列的同源性在91.6%至98.8%之间，氨基酸序列同源性在92.1%至98.6%之间，与国内2012年后分离毒株之间核苷酸序列同源性都超过了97.8%，与经典毒株Fa、Ea、MinA株核苷酸序列同源性在87.9%至96.8%之间。新分离株gB基因扩增核苷酸序列与国内野毒株核苷酸序列的同源性在97.4%至100.0%之间，氨基酸序列同源性在96.6%至100.0%之间，与国内2012年后分离毒株之间核苷酸序列同源性都超过了98.8%，与经典毒株Fa、Ea、MinA株核苷酸序列同源性也达到98.2%以上。新分离株TK基因扩增核苷酸序列与国内野毒株核苷酸序列同源性在98.2%至100.0%之间，氨基酸序列同源性在97.6%至100%之间，与国内2012年后分离毒株之间核苷酸序列同源性高达99%，与经典毒株Fa、Ea、MinA株核苷酸序列同源性也超过了98.4%。

PRV-XJ、PRV-JJ、PRV-MS和PRV-YA新分离株的gE、gB和TK基因都高度保守。大量核苷酸序列对比结果显示，2012以来新流行的PRV变异株之间具有共同的分子特征，即gE基因编码的氨基酸序列第48位和第492位各插入了1个天冬氨酸，此变异处可作为判断PRV是否为变异毒株的重要指标之一[13-14]。

1.4 引物设计

参照GenBank中已发布的序列及SA215、Bartha-K61疫苗株的PRVgE基因、gB基因以及TK基因的序列，分析对比，找出高度保守区段，应用Primier5和Oligo7.0软件,优化设计引物gE-F/gE-R、gB-F/gB-R、TK-F/TK-R(表1)，交上海生工生物工程有限公司合成。

表1引物序列

Table1Sequenceofprimers

基因引物名称 碱基序列 (5'→3') 产物长度 (bp)gEgE-FCATGGTGCTGGGGC-CCACGATCGTC0(Bartha-K61株)、0(SA215株)、531(野毒株)gE-RCGTTGAGGTCGCCGTCGAGGT-CATgBgB-FCCGTCCTCCTTGAGCGYCTTC264(Bartha-K61株)、264(SA215株)、264(野毒株)gB-RCGGCATCGCCAACTTCTTCCTKTK-FCGCACACGCACTGCCGGAT710(Bartha-K61株)、432(SA215株)、710(野毒株)TK-RGCCTTCGCGACGCCGTACCTG

1.5 鉴别gE、gB、TK基因的多重PCR方法的建立

1.5.1 多重PCR反应的退火温度(Tm)优化 在单一基因PCR的基础上，确定30 μl三重PCR优化体系进行试验，在退火温度 60～75 ℃进行梯度试验找出最适退火温度。

1.5.2 多重PCR反应中多个引物浓度优化 二重PCR反应中，固定一对引物浓度改变另一对引物加入量确定其使用量，然后以优化的一对引物加入量不变，改变另一对引物加入量，一同确定2对引物的最适条件。三重PCR反应过程建立在二重PCR的基础上，保持二重PCR引物用量不变确定第三对引物量，最终确定三重PCR最适引物浓度。

1.6 敏感性试验

采用优化后的PCR条件，PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)、PRV变异株(2014年分离的XJ株)分别选择不同模板的量，1 μl 1.8×1011拷贝、1.8×1010拷贝、1.8×109拷贝、1.8×108拷贝、1.8×107拷贝、1.8×106拷贝、1.8×105拷贝进行PCR扩增。

1.7 特异性试验

采用优化后的反应条件和体系分别扩增PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)、PRV变异株(2014年分离的XJ株)、猪圆环Ⅱ型病毒(PCV-2)、细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)。同时用建立的多重PCR检测方法对其他变异株PRV-JJ、PRV-MS、PRV-YA和经典毒株PRV-Fa进行检测。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,然后用溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统下成像、观察。

1.8 重复性试验

采用优化后的反应条件和体系，将PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)和PRV变异株(2014年分离的XJ株)连续扩增3次。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,然后用溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统下成像、观察。

1.9 临床样品检测试验

采用优化后的反应条件和体系，对收集的76份猪伪狂犬病临床样品进行检测。

2 结 果

2.1 多重PCR反应条件优化

通过对多重PCR各种反应条件的试验探索，确定gE、gB、TK基因多重PCR反应体系为：2×GC Buffer Ⅱ 15.00 μl、2.5 mmol/L dNTPs 0.75 μl、20 μmol/LgB上下游引物各0.60 μl、20 μmol/LTK上下游引物各0.75 μl、20 μmol/LgE上下游引物各0.75 μl，模板3.10 μl、HSTaq酶0.75 μl，去离子水补足到30.00 μl。退火温度(Tm)优化为66 ℃，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，66 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，30个循环；最后72 ℃延伸7 min。

PRV野毒(2014年分离的XJ株)条带为264 bp(gB基因)、531 bp(gE基因)、710 bp(TK基因)，PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61条带为264 bp(gB基因)、710 bp(TK基因)，PRV基因缺失疫苗株SA215条带为264(gB基因)、432 bp(TK基因)(图1)。

M：Marker DL1000；1：PRV基因缺失疫苗株SA215；2：PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61；3：PRV变异株(2014年分离的XJ株)。图1 伪狂犬病毒野毒株和疫苗株的多重PCR鉴别Fig.1 Multiplex PCR identification of pseudorabies virus(PRV) vaccine strains and wild viruses

2.2 猪伪狂犬病毒多重PCR检测方法的敏感性

采用优化后的PCR反应条件和体系，用不同浓度模板量1 μl 1.8×1011拷贝、1.8×1010拷贝、1.8×109拷贝、1.8×108拷贝、1.8×107拷贝、1.8×106拷贝、1.8×105拷贝进行PCR扩增反应。结果表明模板量小于1 μl 1.8×106拷贝时没有发现目标条带。

2.3 猪伪狂犬病毒多重PCR检测方法的特异性

用建立的猪伪狂犬病毒多重PCR检测方法检测猪常见疫病病原猪圆环Ⅱ型病毒(PCV-2)、细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)，以及猪伪狂犬病毒其他变异株PRV-JJ、PRV-MS、PRV-YA和经典毒株PRV-Fa。结果(图2)显示，猪圆环Ⅱ型病毒(PCV-2)、细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)均未出现特异性条带，PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)和PRV变异株PRV-XJ、PRV-JJ、PRV-MS、PRV-YA和经典毒株PRV-Fa均有特异性目的条带。

M：Marker DL1000；1：猪圆环Ⅱ型病毒(PCV-2)；2：细小病毒(PPV)；3：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)；4：猪瘟病毒(CSFV)；5：PRV基因缺失疫苗株SA215；6：PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61；7：PRV变异株(2014年分离的XJ株)；8：PRV经典株(Fa株)；9：PRV变异株(YA株)；10：PRV变异株(MS株)；11：PRV变异株(JJ株)；12：PRV变异株(2014年分离的XJ株)；13：PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61；14：PRV基因缺失疫苗株SA215。图2 猪伪狂犬病毒多重PCR检测方法的特异性Fig.2 Specificity of the method for identification of swine pseudorabies virus by multiplex PCR

2.4 猪伪狂犬病毒多重PCR检测方法的重复性

将PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)和PRV变异株(2014年分离的XJ株)连续检测3次，结果完全一致，说明本方法具有良好的重复性和稳定性。

2.5 临床样品检测试验结果

用建立的猪伪狂犬病毒多重PCR检测方法，对收集的76份猪伪狂犬病临床样品进行检测。结果显示PRV野毒株、PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)均可检出，其中39份为PRV野毒株，16份为PRV基因缺失疫苗株SA215，21份为PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61。检测结果与样品来源注射疫苗记录、单一PCR检测及测序结果一致。

3 讨 论

2012年以来，全国超过20个省份先后报道发现PRV变异株[15]。疫情表现为大流行，不同地区PRV变异毒株的毒力水平和感染强度都有较大差异，变异株之间的亲缘关系较近，变异株与国内传统毒株(Fa、Ea及Min-A等)亲缘关系较远[8,15-18]。但变异毒株的起源与传统毒株相同，其中华东地区的感染率最高，分离的变异株毒力最强[19]。对新发现PRV变异毒株的研究结果表明，当前各地区流行的不同变异毒株在毒力增强的同时抗原也发生了一定程度的变异[17-18]。这也解释了当前广泛使用的基因缺失疫苗株SA215、Bartha-K61无法对变异猪伪狂犬病毒侵染提供完全免疫保护的原因[20-24]。

本试验所建立的区分猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR检测方法能够可靠、快速、有效地鉴别野毒株和疫苗株，区分度大。研究中针对PRV的3个重要高度保守基因gE、gB和TK基因设计了3对特异性引物，通过PCR扩增条件的优化，确定3对引物的最佳退火温度为66 ℃。在单引物敏感性试验的基础上，通过优化引物浓度，最后建立了多重PCR检测方法。试验结果表明，gE、gB、和TK基因的高度保守确保了扩增片段的正确性，避免了假阳性结果的发生，3个基因的目的条带264 bp(gB)、432 bp(TK)、531 bp(gE)和710 bp(TK)区分度较高，通过电泳能够直观区分野毒株和疫苗株。敏感性试验结果显示，本研究的多重PCR检测方法能够检测的最低浓度为1 μl 1.8×106拷贝，具有较高的灵敏度。用多重PCR方法对收集的76份临床样品进行检测，检测结果完全正确，与普通检测方法一致，证明本方法切实有效。本研究所建立的多重PCR检测方法可用于目前PRV疫情检测，为控制猪伪狂犬病毒大流行、大爆发提供了一种可靠、快速、有效的检测方法，对切实防控猪伪狂犬病具有十分重要的意义。