用于检测转基因作物中调控元件的质粒标准分子的构建

邢宇俊，陆丹丹，吴季荣，徐剑宏，王园园，梁 杰，史建荣

(江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室/农业部农产品质量安全风险评估实验室/江苏省转基因安全评价公共服务中心/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心/中德农产品质量安全评估技术研发中心,江苏 南京 210014)

自从首例转基因产品被批准商业化生产以来，转基因作物在不同的国家和地区开始大规模地商业化种植，截至2017年，全球24个国家转基因作物种植面积达到 1.898×108hm2[1]。越来越多的已批准的转基因农产品出现在市场上，比如：转基因玉米、大豆、油菜、苜蓿、木瓜、棉花、甜菜、马铃薯等[1]。但随着转基因作物在全球范围内迅速发展，其环境和食品安全性问题一直受到人们的关注，因此，对转基因农产品的检测有利于政府职能部门对其进行监管和监督。

目前，转基因作物检测的常用方法是提取检测样品的DNA，进行定性PCR[2]或定量PCR检测[3]。在PCR检测过程中，必须设置阴性对照和阳性对照，确保检测结果的可比性、溯源性，标准物质的作用十分重要[4-5]。检测结果的可靠性、准确性、有效性需要阳性标准物质(包括标准质粒)作对照，因此阳性标准物质在转基因农产品检测中是不可缺少的。

虽然现在转基因的转化体比较多，但市场上销售的标准物质种类有限，价格比较高，很多标准品来自欧盟标准物质与测量研究所(IRMM-CRL) 和美国油料化学家协会( AOCS)，种类主要包括转基因玉米、大豆、油菜、水稻、棉花、甜菜等60余种[6]。而国内这些标准物质主要依赖于进口，而且以植物原材料制备标准物质非常复杂，不仅需要精密的仪器设备，而且对环境要求也比较高。虽然国内也有部分转基因标准物质商业化，例如由中国计量科学研究院研制的Bt63，但种类有限。这些标准物质针对的是特定品系。根据转基因产品的特征，检测方法等，建立了相关的数据库，例如由上海交通大学建立的GMDD(http://gmdd.shgmo.org/)，以及欧盟转基因实验室建立的ENGL (http://gmo-crl.jrc.ec. europa .eu/engl/engl. html)。通过比较转基因品系外源基因的信息，发现它们自身包含1种或几种特定的启动子或终止子，并不涵盖多个启动子或终止子。玉米中常使用的调控元件是CaMV35S启动子(35S)、NOS启动子(PNOS)、FMV35S启动子(FMV35S)、PTA 29启动子(PTA29)、Ubiquitin启动子(Ubiquitin)、35S终止子(t35S)、nos终止子(tNOS)、E9终止子(tE9)。因此，选择这些调控元件构建阳性质粒，可以更好地用于农产品中转基因成分的检测。

阳性标准质粒分子的构建是采用目的外源基因片段进行特异性扩增，重组于质粒分子上，转入微生物中进行大量培养。优点是质粒DNA容易提取且纯度高，稳定性好，并且一个质粒分子中可以包含多个外源目的基因[7]。可以有效解决阳性标准品缺乏和阳性标准品制备困难的问题，因此被称为“金标准物质”[8]。

随着国内外对转基因检测要求的不断提高，检测方法开始从定性PCR向定量PCR转变，用质粒分子作为定量标准物质易于操作。现阶段，国内质粒分子标准物质已经在玉米[9-10]和大豆[11]转基因检测中得到很大的发展，并且已有质粒分子标准物质(MON810)申请了有证标准物质[12]。但是这些研究是针对一种转化体或一类作物，而在没有标准物质的经济作物、蔬菜、未知材料的检测时，需要通用型标准物质。因此，本研究根据转基因品种调控基因的特性，将多个启动子和终止子整合到质粒分子中，构建标准质粒分子，用于大多数已经批准的转基因作物的检测和监管。

1 材料与方法

1.1 植物样品与试剂

TaqDNA聚合酶购自Promega生物技术(美国)有限公司，植物基因组提取试剂盒购自Axygen生物技术有限公司，质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA marker、dNTPs、pMD-19T购自TaKaRa生物工程(大连)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。大肠杆菌DH5a菌株本实验室保存。转基因大豆品系GTS 40-3-2、MON87705、MON89788和A5547-127，转基因玉米品系Bt11、MON810、Bt176、NK603和TC1507，转基因油菜品系GT73、MS1、RF1和Oxy235，购于美国AOCS公司和上海佑隆生物有限公司。转基因水稻KF6和TT51-1由农业部科技发展中心提供。

1.2 质粒pMD-RG的设计

针对国内外检测标准中通用元件基因，构建含有一批启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子CaMV35S、玄参花叶病毒35S启动子FMV35S、烟草花药组织特异基因TA29启动子 PTA29、玉米泛素蛋白基因启动子Ubiquitin、胭脂碱合成酶基因NOS的启动子PNOS)和终止子(花椰菜花叶病毒的35S终止子t35S、胭脂碱合成酶基因NOS终止子tNOS、豌豆1,5-二磷酸核酮糖羧化酶E9基因终止子tE9)的多靶标调控原件标准质粒分子，命名为pMD-RG。设计的质粒图谱及大小见图1。

1、2、3、4、5分别代表启动子CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS，6、7、8分别代表终止子t35S、tNOS、tE9。图1 重叠PCR法构建标准质粒的示意图Fig.1 Diagram of standard plasmid constructed by overlapping PCR

1.3 质粒pMD-RG的构建

根据CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS、t35S、tNOS、tE9的相关序列信息以及国家标准中使用的引物序列，添加合适的引物互补接头(表1),利用重组PCR技术将相邻片段连接起来，构建示意图见图1。首先用引物35S-F/35S-FMV35S-R扩增CaMV35S启动子，用引物FMV35S-F/FMV35S-PTA29-R扩增FMV35S启动子，将两部分扩增产物作为模板，用引物35S-F/FMV35S-PTA29-R进行重组PCR，从而将CaMV35S启动子和FMV35S启动子2个片段连接在一起，以CaMV35S+FMV35S表示；同样的方法获得PTA29+Ubiquitin、PNOS+t35S和tNOS+tE9。再以CaMV35S+FMV35S和PTA29+Ubiquitin扩增产物为模板，用引物35S-F/Ubiquitin-PNOS-R进行重组PCR扩增，获得CaMV35S+FMV35S+PTA29 +Ubiquitin片段；以PNOS+t35S和tNOS +tE9的扩增产物为模板，利用引物PNOS-F/tE9-R 进行重组 PCR 扩增，获得PNOS+t35S +tNOS+tE9,最后以CaMV35S+FMV35S +PTA29+Ubiquitin和PNOS+t35S+tNOS+tE9的扩增产物为模板，利用引物35S-F/tE9-R进行重组PCR扩增，获得CaMV35S+FMV35S+ PTA29+Ubiquitin +PNOS+t35S +tNOS+ tE9的整体序列，用于质粒分子调控元件的构建。将构建好的质粒转入大肠杆菌感受态细胞DH5a中，挑选单克隆在LB培养基(含有Amp)中培养，培养条件200 r/min，16 h。提取质粒进行验证。

表1重组PCR引物

Table1OverlappingPCRprimers

启动子和终止子 引物名称 引物序列(5'→3') 扩增片段大小(bp)CaMV35S35S-FGCTCCTACAAATGCCATCATTGC19535S-FMV35S-RggtggatgtcttGATAGTGGGATT GTGCGTCATCCCFMV35SFMV35S-FAAGACATCCACCGAAGACTTA210FMV35S-PTA29-RccacccaccttaAGGACAGCTCTTTTCCACGTTPTA29PTA29-FTAAGGTGGGTGGCTGGACTA266PTA29-Ubiquitin-RcttgccagtgttACTTGCACCACAAGGGCATAUbiquitinUbiquitin-FAACACTGGCAAGTTAGCAAT314Ubiquitin-PNOS-RacgtaaaacggcCCGTAATAAATAGACACCCPNOSPNOS-FGCCGTTTTACGTTTGGAACTG183PNOS-t35S-RcatgagcgaaacTTATGGAACGTCAGTGGAGCt35St35S-FGTTTCGCTCATGTGTTGAGC121t35ST-tNOS-RgcaacaggattcGGGGATCTGGATTTTAGTACTGtNOStNOS-FGAATCCTGTTGCCGGTCTTG180tNOS-tE9-RccaatgccataaTTATCCTAGTTTGCGCGCTAtE9tE9-FTTATGGCATTGGGAAAACTGT273tE9-RATATATTCTTCGGTCATTAGAGGC

引物中小写部分为接头。

1.4 重叠PCR扩增

用添加互补接头的特异性引物分别扩增出含有接头的基因片段。PCR体系：10×PCR buffer 2.500 μl，Mg2+2.500 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)2.000 μl，上游引物 0.750 μl，下游引物 0.750 μl，DNA模板(50～100 ng)1.250 μl，TaqDNA聚合酶0.125 μl，补水至25.000 μl。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环35次；72 ℃延伸7 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析，将获得的正确片段条带进行切胶回收。

将含有互补接头的胶回收产物进行连接，进行重叠PCR。PCR体系：10×PCR buffer 2.50 μl，Mg2+2.50 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)2.00 μl，DNA模板各1.00 μl，TaqDNA聚合酶0.25 μl，补水至25.00 μl。反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火10 min，72 ℃延伸3 min，循环15次；72 ℃延伸10 min。反应体系中添加第1段基因的正向引物和第2段基因的反向引物，其他反应体系和条件不变。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析，将获得的大小正确的条带进行切胶回收。胶回收产物即为2个片段的连接产物。

1.5 重组片段克隆与验证

PCR扩增得到的特异性片段与pMD19-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，涂布含Amp的LB固体培养基，37 ℃培养12 h。挑取单菌落，进行PC扩增验证和测序验证。

PCR 扩增验证：利用表2中不含接头的引物对标准质粒pMD-RG的外源插入基因进行验证，检验所构建的质粒是否能够扩增预期的所有片段。PCR反应体系和反应条件同方法1.4中含有接头的基因片段的扩增，利用2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，比较目的基因扩增产物同预期片段大小是否一致。

测序验证：由生工生物工程(上海) 股份有限公司完成质粒分子的测序验证。测序结果分别同NCBI进行blast，验证载体中序列的准确性。

1.6 pMD-RG质粒分子检验及应用

按照标准物质的国家标准JJG 1006-1994[13]，对构建的标准质粒pMD-RG进行均匀性和稳定性检验。

均匀性检验：取样方法按国家标准JJG 1006-1994 技术规范进行。将稀释至1 μl 1×106拷贝的质粒溶液以500 μl分装至冻存管中，共分装300 管。从中随机取10 管，分别标记为 1～10，对各管质粒分子中的每个目标片段进行检测。

稳定性检验：对质粒样品进行短期稳定性比较。将质粒溶液稀释至1 μl 1×106拷贝，以每管50 μl 分装至0.2 ml的PCR管内，分别将样品置于25 ℃、4 ℃、-20 ℃、-70 ℃存放，在第1 d、第7 d、第14 d、第21 d和第28 d时对质粒样品进行PCR检测，对样品的稳定性进行比较。

pMD-RG质粒分子的应用：分别以构建的标准质粒分子pMD-RG和基质标准品中提取的DNA为模板，进行PCR扩增，比较质粒分子中各调控元件的扩增和稳定性与基质标准品是否一致。PCR体系及扩增程序同方法1.4中含有接头的基因片段的扩增。

2 结果与分析

2.1 重叠PCR扩增获得的启动子和终止子重组片段

根据图1所示，进行载体构建。利用表1中各基因的上游和带有互补接头的下游引物分别扩增，PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图2。正确的片段切胶回收后，将含有互补接头的胶回收产物进行连接，以此作为模板进行重叠PCR，电泳后切胶回收获得连接产物，即为2个片段的连接产物(图2)。

确定条带大小正确后，进行切胶回收，再将2个片段连接起来。分别为CaMV35SS+ FMV35S(405 bp)、PTA 29 +Ubiquitin(580 bp)、PNOS +t35S(304 bp)、tNOS +tE9(453 bp)(图3A、图3B、图3C、图3D)。之后再拼接上述片段，即CaMV35S +FMV35S +PTA 29 +Ubiquitin(985 bp)和PNOS +t35S+tNOS+tE9(757 bp)(图3E、图3F)。最后，将2个大片段整合起来，得到完整的8个调控元件的片断(1 742 bp)(图3G)。

2.2 转基因筛查阳性质粒的鉴定

利用分子克隆方法，将重叠PCR扩增获得的重组片段连接到质粒载体pMD-19T上，构建转基因筛查阳性质粒pMD-RG。对重组质粒进行鉴定和验证。

通过紫外分光光度计测量DNA 纯度及质量浓度，测定其在260 nm、280 nm处的紫外光吸收值，将质量浓度稀释为50 ng/μl。测定结果表明，260 nm与280 nm处的吸光值比值在1.80至2.00 之间，260 nm与230 nm处的吸光值比值在2.0至2.3之间，说明DNA 纯度符合质粒标准分子要求。

M：DL 2000 bp marker；1：阴性对照；2～5：模板为含有目标基因的转基因材料；启动子CaMV35S和终止子tNOS以转基因大豆GTS40-3-2为模板；启动子FMV35S、终止子tE9以转基因油菜GT73为模板；启动子PTA29以转基因油菜MS1为模板；启动子PNOS以转基因油菜RF1为模板；终止子t35S以转基因玉米Bt176为模板；启动子Ubiquitin以转基因玉米MON810为模板。图2 转基因作物中启动子和终止子的扩增Fig.2 Amplification of promoter and terminator of transgenic crops

M：DL 2000 bp marker；1：阴性对照；2～5：连接后的片段。A:CaMV35S+FMV35S;B:PTA29+Ubiquitin;C:PNOS+t35S;D:tNOS+tE9;E:CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin;F:PNOS+t35S+tNOS+tE9;G:CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin+PNOS+t35S+tNOS+tE9。图3 启动子和终止子的连接片段Fig.3 The segment connection of promoters and terminators

利用表1中各基因的上、下游引物，对标准质粒pMD-RG的外源插入片段进行验证[14-15]。结果显示，扩增条带片段大小与预期片段大小一致(图4)，各片段大小分别为CaMV35S 195 bp、FMV35S 210 bp、PTA29 266 bp、Ubiquitin 314 bp、PNOS 183 bp、t35S 121 bp、tNOS 180 bp、tE9 273 bp，表明载体构建成功。同时对质粒分子进行测序验证(图4)。BLAST分析结果表明：pMD-RG克隆序列长1 742 bp，与实际碱基序列完全吻合。

a图中， M为DL 2000 bp marker，NC为空白对照，1～8依次为CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS、t35S、tNOS、tE9；b图中，下划线表示质粒标准分子构建中所用的引物位置。图4 标准质粒pMD-RG的PCR扩增验证(a)和测序验证(b)Fig.4 PCR amplification and sequencing validation of standard plasmid pMD-RG

2.3 pMD-RG质粒分子的均匀性和稳定性

将pMD-RG质粒标准分子同一稀释到1 μl 1×106拷贝，分装，随机抽取其中的10管进行均匀性检验。PCR扩增结果(图5)显示10管质粒标准分子都扩增出对应的8个调控基因片段，说明质粒标准分子各管间均匀性良好。

M：DL 2000 bp marker；1～10：随机抽取的10管质粒分子。图5 pMD-RG质粒标准分子均匀性验证Fig.5 Verification of uniformity of standard plasmid molecules of pMD-RG

对pMD-RG质粒分子进行短期内稳定性检验。PCR扩增结果(图6)表明，pMD-RG质粒分别在25 ℃、4 ℃、-20 ℃、-70 ℃温度下存放1 d、7 d、14 d、21 d、28 d，扩增结果均很好。说明短期内pMD-RG标准质粒稳定性好，扩增结果可靠。

2.4 pMD-RG质粒分子的应用分析

对构建的质粒pMD-RG进行PCR扩增鉴定。从表2可以看出，质粒pMD-RG中各调控元件均得到了扩增并与基质标准品的结果一致，证明构建的含调控元件的筛查质粒分子pMD-RG可以作为转基因作物检测的阳性标准品用于转基因成分检测。

表2转基因作物筛查质粒pMD-RG的PCR扩增鉴定

Table2PCRidentificationofscreeningplasmidpMD-RGfortransgeniccrop

转基因作物品系CaMV35SFMV35SPTA29UbiquitinPNOS t35StNOStE9Bt11+NN+NN+NBt176+NN+N+NNMON810+NN+NNNNNK603+NN+NN+NTC1507+NN+N+NNA5547-127+NNNN+NNGT73N+NNNNN+TT51-1NNNNNN+NKF6+NNNN++NMS1NN+N+N+NRF1NN+N+N+NGTS40-3-2+NNNNN+NMON89788NNNNNNN+OXY235+NNNNN+N

+:检测出相应条带;N:没有检测出。

3 讨 论

转基因作物的种植面积在逐年扩大。在中国，每年都有转基因品系获得进口证书，2017年农业部发布转基因生物安全证书(进口)清单，批准孟山都、拜耳、先正达等公司的16个转基因生物安全证书(进口)，涉及的转基因生物为大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜，用途皆为“加工原料”[16]。截至目前，中国进口的转基因产品扩大到46种，对这些获得进口证书的转基因产品的监管比较严格。然而，对进口产品中混杂的非法进口的转基因品种或实验室产品扩散的监管更为重要。对于未知产品的检测，当前采用的主要方法是通用元件基因检测，之后对转化体品系进行分析。在检测过程中，阳性标准物质是检测过程中的标尺，然而由于来源于植物原材料本身的标准物质的制备过程非常复杂，需要精度很高的设备，生产成本较高，保存环境要求高等因素，获得所有不同转基因植物的标准样品难度比较大[17]。而标准质粒分子是一种重组质粒分子，根据需要可组合转基因作物的内源基因，待检测的外源基因，转化体特异性片段，该物种特异性片段，也可插入多组外源基因，并且制备上操作简便，生产成本低，容易获得高纯度质粒标准分子DNA样品[18]。因此含有通用元件的质粒作为阳性对照在检测中使用比较便捷。

在质粒构建过程中，如果选择常规的质粒载体构建方法，一般利用酶切位点进行重组克隆，而有时酶切的选择和位点引入存在一定难度，同时在构建过程中要进行多次酶切和连接操作，这使得构建过程繁杂而且构建成本也较高[19]。本研究中选择的重叠PCR技术比较方便快速。重叠PCR最初是用于基因定点突变中[20]，后来被扩展应用到2个片段的拼接[21]。该技术也曾在其他质粒分子的构建中使用，设计的引物中有18～25个碱基重叠，重叠序列能将相邻的8个目标DNA片段连接[22]。本研究将8个调控元件单独扩增后，利用重叠PCR技术将这些调控元件片段融合在一起，进行克隆，构建了含有8个调控元件的质粒载体，相对于引入酶切位点的重组克隆，该技术更便捷快速。

本研究构建的含有调控元件的标准质粒均匀性一致，短期稳定性好。已构建好的标准质粒分子可以在低温环境下(4 ℃、-20 ℃、-70 ℃)保存3个月，对检测结果没有影响[23-24]。用标准质粒作为标准物质，可以避免在检测过程中阳性物质的多次提取，减少阳性物质对实验室的污染。通过分析国外已批准商业化和国内处于环境释放阶段材料的插入元件信息，以及国内检测标准的需要，选择转化体中通用调控元件构建筛查质粒，构建的筛查质粒可以覆盖绝大多数转基因转化体，可作为转基因产品检测和监管的对照标准物质。