外泌体与糖尿病肾病相关研究的最新进展

胡 燕

糖尿病肾病（DN）是一种严重的微血管并发症，常与1型和2型糖尿病相关，是肾功能衰竭的主要原因，也是发达国家终末期肾病（ESRD）的主要原因之一［1］。DN是由葡萄糖代谢紊乱引起的肾小球毛细血管和管状结构功能改变引起的进行性肾脏疾病。肾小管间质纤维化（ECM）被认为是糖尿病肾病进展的主要决定因素。尽管过去几十年已经在诊断和治疗DN患者方面取得了重大进展，但仍未能显著降低这一人群的病死率，迫切需要寻找早期发现、早期诊断和早期治疗DN的生物标志物。近几年有关外泌体在肾脏疾病中的研究越来越多，外泌体是由细胞产生并存在于体液中的细胞外囊泡（EV）［2］。 外泌体含有多种生物分子，例如脂质，蛋白质，miRNA和mRNA，现已证明外泌体通过在细胞间转移核酸、蛋白质、脂质等特定组成从而在细胞间通讯中发挥着关键作用，并参与多种肾脏疾病的发生发展。

1 外泌体的起源及生物学特性

外泌体是由大多数细胞分泌的直径40～100 nm的细胞外囊泡，特别是免疫系统细胞，如巨噬细胞［3］，B 细胞［4］和 T 细胞［5］，以及间充质干细胞［6］，内皮细胞［7］和上皮细胞［8］。 研究证明多种癌细胞也可分泌外泌体［9］。它们可以在多种类型的细胞外液中发现，如血液，尿液，羊水，唾液，脑脊液，甚至母乳［10-13］。

外泌体由不同的生物分子组成，包括DNA、RNA、蛋白质、脂质。在透射电子显微镜下，外泌体是由脂质双分子层组成的呈杯型的囊泡。所有外泌体都含有膜转运和融合蛋白（GTPases，膜联蛋白，flotillin），tetraspannins（CD9，CD63，CD81，CD82），热休克蛋白（Hsc70，Hsp90），参与多泡体生物发生的蛋白质（Alix，TSG101），以及脂质相关蛋白和磷脂酶。由于不同细胞来源的外泌体其蛋白质有一定差异，目前最广泛使用的“外泌体标志物”包括四种跨膜蛋白（Alix，flotillin，TSG101 和 Rab5b）。 除了蛋白质外，外泌体还富含脂质，如胆固醇（主要是B淋巴细胞），神经酰胺（与外来体分离溶酶体有关），以及具有长饱和脂肪酰基链的磷酸甘油酯［14，15］。Batista等［16］也发现外泌体表面富含甘露糖、聚乳糖胺、α-2，6唾液酸和复杂的N-连接聚糖等糖集团。外泌体还含有细胞因子、转录因子受体、生长因子受体和其他生物活性分子。研究提示，信号通过三种方法从外泌体转移到受体细胞：受体-配体相互作用，直接膜融合和内吞作用/吞噬作用。迄今为止，分离外泌体多种方法可用，包括超速离心、蔗糖梯度超速离心结合超滤离心 （SGUUC）、磁性激活细胞分选（MACS）和商业试剂盒。根据实验要求，可以使用不同的方法分离外泌体［17］。

2 外泌体在糖尿病肾病中的研究进展

DN是终末期肾衰竭的主要原因，与其他导致肾病的原因相比，其与糖尿病发病率和病死率增加有关。白蛋白尿通常是DN的第一个临床指标。然而，微量白蛋白尿具有一定的局限性：首先，它不能用于DN的病因诊断，因为它只是内皮损伤的标志物；其次，它与肾脏损害的类型和数量无关；最后，它不是DN的必要条件：事实上，已知一些糖尿病患者在没有出现白蛋白尿的情况下恶化为肾功能衰竭。除白蛋白之外的其他蛋白质已确定为DN的诊断标志物，如，β2微球蛋白（β2MG）和泛素。但这些蛋白质也有局限性：β2MG是肾小管损伤的标志物，直到现在还没有研究比较糖尿病和非糖尿病肾病患者的尿β2MG排泄。泛素作为诊断标志物也因为尿液水平与DN组织学分类之间缺乏相关性而受到限制。白蛋白尿或蛋白尿是患有各种肾病的患者的常见症状，因此，仍作为诊断DN的特定生物标志物。

尿液是肾脏疾病生物标志物的理想来源，如尿液mRNA分析已作为发现生物标志物的工具。然而，尿中的mRNA通常来自凋亡或坏死细胞，很容易被尿RNase降解，几乎没有代表性的转录谱。但尿液中的外泌体携带的RNA可以传递到远处的靶细胞，是细胞间通讯的重要途径，与尿游离RNA不同，外泌体核酸以明显稳定的形式存在，因为受微泡保护免受内源性RNase活性的影响。此外，它们来自所有肾单位的活细胞，有可能为肾脏病理生理学提供有价值线索。Zubiri等［18］通过对DN和健康对照者的尿外泌体进行差异定量分析，首次鉴定了352种与人类尿液外泌体相关的蛋白质，并发现三种蛋白质（AMBP，MLL3和 VDAC1）在 DN 中的变化，为改善DN的早期诊断、预测DN的进展，以及监测DN对治疗的反应开辟了一个新的研究领域。Jiang等［19］也提出了可将外泌体用于治疗DN的研究，将人尿液干细胞中提取的外泌体（USCs-Exo）静脉注射到Ⅰ型糖尿病大鼠，由于外泌体很少足细胞凋亡因而能改善Ⅰ型糖尿病大鼠的肾损伤，这可能与人尿液干细胞（USCs）中潜在的细胞因子VEGF、TGF-β1、血管生成素和BMP-7有关。USCs-Exo的应用有望成为治疗DN的新方法。当然这需要进一步研究关于足细胞或内皮细胞外泌体作用的机制和途径。

2.1 DN诊断方面外泌体WT1的水平与尿蛋白-肌酐比，白蛋白-肌酐比和血清肌酐的显著增加以及eGFR的下降相关。此外，与尿液WT1阴性患者相比，WT1阳性的患者肾功能降低。ROC曲线分析显示WT-1能有效预测eGFR<60 ml/min·1.73 m2患者。WT1蛋白主要在糖尿病患者的尿外泌体中存在，而且其表达水平随着肾功能的下降而增加，表明它可以用作糖尿病肾病的早期非侵入性标志物［20］。最新研究［21］表明尿外泌体WT1可预测未来几年eGFR的下降，因而可作为改善DN患者危险分层的有用生物标志物。Zubiri等［22］对大鼠尿外泌体分析发现，与健康动物相比，糖尿病大鼠的尿外泌体中的Regucalcin蛋白减少，从而反映病理组织的变化，但这需要进一步的前瞻性研究，评估疾病进展和治疗过程中regucalcin的水平变化，揭示regucalcin与白蛋白尿，eGFR和生物标志物变化的相关性并评估regucalcin与其他传统或新型生物标志物相比或与之相结合的预测潜力，从而进行更精确的疾病分期和治疗的个体化。总之，DN肾组织中regucalcin蛋白表达明显降低，在糖尿病肾病患者尿分离的外泌体中有所表现，故尿外泌体regucalcin可作为探索糖尿病肾病的早期诊断和进展监测的新工具。Mohan等［23］证实了在糖尿病进展期糖尿病大鼠尿液外泌体中miR-451-5p和miR-16水平逐渐升高，但在糖尿病大鼠肾脏中均减少，肾组织miR-451-5p和miR-16表达（10周时）与尿液水平无相关性，与肾脏病理指标呈负相关。从而提出糖尿病患者肾miR-451-5p和miR-16的相对升高对糖尿病引起的肾纤维化有保护作用，而UE miR-451-5p作为肾脏疾病的早期、敏感的非侵袭性指标，可能具有预后价值，但有待进一步研究确定miR-451-5p作为一种非侵入性工具连续监测糖尿病肾损伤的潜力。 有研究［24，25］报道尿外泌体中 miR-29c 的水平可反映肾功能和组织学纤维化程度，而作为肾纤维化的新型非侵入性标志物。Krishnamurthy等［26］通过连续离心将尿外来体与全尿分离，并通过ELISA测量血浆铜蓝蛋白，发现糖尿病肾病患者的尿外泌体中明胶酶活性降低和血浆铜蓝蛋白水平升高与肾组织中这两种蛋白质的改变一致，而全尿中这两种蛋白质的水平变化很大，并且与糖尿病肾组织中的表达水平无关，尿液外泌体中的蛋白质标志物比全尿样本能更好地反映肾脏中潜在的蛋白质变化，因此尿液外泌体用于糖尿病肾病的诊断和监测疾病进展似乎是一种有潜力的方法。最近［27］有人对健康对照、Ⅱ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病肾病患者的尿液外泌体进行分析，发现Ⅱ型糖尿病肾病患者尿外泌体衍生的let-7c-5p在DN患者的尿外泌体中显著上调（P<0.05），并且与肾小球滤过率（P<0.001）和DN的进展相关，其预测DN的AUC为0.81，也可作为DN的一种潜在生物标志物。

2.2 在糖尿病肾病机制研究方面肾纤维化是各种慢性肾病的标志，TGF-β是肾纤维化的关键介质［28］。肾小球内皮细胞（GEC）和肾小球系膜细胞（GMC）之间的相互作用是糖尿病肾病（DN）的重要方面。研究证明，与正常葡萄糖（NG）处理的GEC相比，高糖（HG）处理的GEC分泌更多数量的高度富集 TGF-β1mRNA的外泌体，并通过 TGF-β1/Smad3信号传导途径促进GMC中的α-平滑肌肌动蛋白表达，细胞增殖和细胞外基质蛋白过量产生，从而促进肾纤维化［29］。Delic 等［30］首次证明了Ⅱ型DN患者的尿外来体中miRNA谱的改变，他们使用qRT-PCR方法发现miRNA miR-320c和miR-6068在DN患者的尿外泌体中显著上调，其中miRNA miR-320c通过靶向血小板反应蛋白1（TSP-1）可能对TGF-β信号传导途径产生影响从而促进DN的病情进展，并且上调的miR-320c可诱导BMP6的下调和TSP-4表达抑制，进一步加速肾纤维化过程，为DN的病理机制提供了新的见解。Ebrahim等［31］进行大鼠体外实验研究了外泌体对DN的肾保护机制，他们发现间充质干细胞（MSC）衍生的外泌体可以抑制糖尿病大鼠肾脏体内mTOR信号通路，加强自噬调节能力来改善肾功能，从而在糖尿病肾病进程中起到保护肾脏的作用。 这些发现也为将来使用外泌体作为DN的新生物治疗方法提供了基础。

2.3 在糖尿病肾病治疗方面Jiang等［19］提出了可将外泌体用于治疗DN的研究。在Nagaishi等［32］的研究中认为骨髓间充质干细胞分泌的外泌体携带的mRNA或miRNA在肾小管上皮细胞的保护和再生中起作用，其机制主要是通过抑制TEC中TGF-β过度表达和DN中管周上皮纤维化，从而保护肾小管上皮细胞免于凋亡，并保护紧密连接结构，因此MSC-CM中包含的外泌体可能是骨髓间充质干细胞的治疗效果的关键因素。最近Nagaishi等［33］也发现脐带提取物含有富含外泌体，从脐带提取物纯化的外泌体可能是一系列细胞活化因子，可以增强糖尿病肾病患者骨髓间充质干细胞增殖并改善其修复功能，以及抑制内质网应激改善糖尿病肾损伤。预想，脐带提取物或许可以提高骨髓间充质干细胞自体细胞移植的治疗效果。

综上所述，外泌体是一种存在于多种体液中，功能多样且容易提取的小分子囊泡，在细胞间传递信息，是细胞间通讯的重要途径，与糖尿病肾病的发生、诊断、预后密切相关，有希望成为检测糖尿病肾病的新型标志物，并且已有用于糖尿病肾病治疗的研究。在糖尿病肾病诊断及治疗中的机制仍须进一步研究。