基于免培养的微生物群落多样性研究方法概述

李冬娟

(皖北卫生职业学院，安徽 宿州 234000)

随着科技的发展，对微生物的研究已经不局限于单一菌落，而是更注重对微生物群落结构的研究.传统的培养方法，在研究微生物群落多样性方面做出了很多贡献，但也存在着不足之处.如培养周期长，耗时久；要达到无菌操作，其实验准备工作繁琐；培养时得设定一定的温度、培养基的营养成分、pH值等，只能在某一特定的培养条件下培养，培养条件单一，难以全面的反映微生物群落的多样性和微生物群落的结构组成.已有研究表明，可培养的微生物仅占自然界的1%[1-2].随着分子生物学技术的发展应用，可以通过免培养的方法，分析样品中微生物的核酸序列，从基因水平对微生物群落组成进行定量和定性分析，这样可以更全面地分析微生物群落的组成、遗传的多样性及其与环境间的关系.本文就目前应用于微生物群落分析的免培养方法进行总结.

1 不基于微生物总基因组DNA的分析方法

不基于微生物总基因组DNA的分析方法主要是通过测定样品中生物标记物的含量来反映微生物的组成.一般选取的生物标记物是微生物细胞的生化组成成分，其总量与相应生物量呈正相关.由于特定结构的生物标记物标志着特定类型的微生物，因此可以分析一些生物标记物的种类、数量和相对比例来估算样品中微生物群落的组成.因为该方法分析的是样品中所有的生物标记物，一些难以通过传统培养方法培养的微生物都包含其中，所以相对于传统的培养方法而言，其结果更全面.

20世纪80年代以来常用于研究微生物群落多样性的生物标记物方法有：醌指纹法(Quinones Profiling)、脂肪酸谱图法(PLFAs和WCFA-FAMEs).White和Findlay于20世纪70年代末，80年代初发展了磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA)谱图分析技术，对样品中的微生物群落组成进行定量分析.之后也有学者将该方法应用于土壤和受污染水体中微生物群落组成的研究中.

脂肪酸含量会因为生长期不同，环境不同而发生改变.因此可通过环境因素标准化来改善环境因素对结果的影响.美国的MIDI公司已经将PLFA技术商品化.常见的微生物PLFA谱图，基本上都包括在其数据库内，而且对于某些特定菌种，仪器要求也由GC-MS降为GC.PLFA方法的不足之处在于，一方面对微生物的分类还不够精确，只能根据某些相同生理特征分成一个大的类群；另一方面， PLFA方法不能用来分析生态系统中单个菌株或种水平上的微生物，因为尚未确立所有微生物的特征性磷脂脂肪酸.因此，在分析微生物群落时通常将该方法和其他方法结合在一起使用.

2 基于微生物总基因组DNA的分析方法方法

2.1 荧光原位杂交(Fluorescence Insitu Hybridization，FISH)

FISH结合了显微镜的可视性和分子生物学的精确性.该方法是以标记的细菌核糖体具体的某个区域为探针，然后用荧光显微镜和流式细胞仪来观察结果.一般整个过程只需几个小时.FISH技术可以揭示研究对象的形态学特征，检测环境中的微生物量，以及微生物之间的相互作用[3].FISH已经广泛的用于环境和食品微生物学中，如检测并鉴定葡萄酒里面的乳酸菌，分析奶酪表面的菌群[4]，研究发酵食品里面的益生菌双歧杆菌以及海洋食品中短乳杆菌等.FISH技术也存在着一些不足，如自动化程度低、难以应付高通量样品；根据样品特点需要事先设计足够的探针以备试验所需，杂交率低等问题.目前该技术有了新的发展，如催化报告沉积荧光原位杂交技术 (Catalyzed reporter deposition-FISH，CARD-FISH)，有学者已经将该项技术应用于土壤、海洋和底泥等环境中微生物群落结构的研究中[5].

2.2 变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳(PCR-Denaturant Gradient Gel Electrophoresi and PCR-Temperature Gradient Gel Electrophoresis，PCR-D/TGGE)

该方法是根据核酸碱基序列中GC碱基对的含量影响Tm值的原理设计的.自1995年Muzyer等首次将该方法用于微生物群落多样性的研究以来，目前该方法已被应用到分析受污染土壤、水体、原油、食品如矿泉水、牛肉、乳制品、葡萄酒、奶酪、泡菜发酵玉米粉等的微生物群落组成情况.

用DGGE法研究微生物群落时，一般只能检测到环境中的优势菌群.如：只能分离较小的片段(500bp以内)，提供信的息量有限.燕平梅、蔡宏宇等分别采用PCR- DGGE技术分析泡菜、枣阳酸浆水中的优势菌群[6-7].DGGE分析法在实验条件不适宜时，有可能会出现条带共迁移现象，因此会低估样品中微生物群落的多样性.

2.3 PCR-单链构象多态性(single strand conformational polymorphism，PCR-SSCP)

临床上最初将该方法用于鉴定基因突变，近年来逐渐被应用于微生物群落多样性的研究中.该方法的原理是，不同构象的DNA分子在聚丙烯酞胺凝胶中受到的排阻不同，DNA分子中碱基配对等形成的作用力可以维持DNA单链片段的空间构象.当碱基发生改变时，其空间构象也会随之发生改变.因此，可以通过非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)，将构象上有差异的分子分离开.

SSCP与DGGE的共同点是它可以将长度相同序列不同的DNA碎片区分开.与DGGE不同的是，SSCP是依靠不同序列的DNA单链分子形成不同空间构象而将其区分开.然而，因为不需要GC夹做引物，这一点SSCP的PCR产物比DGGE更有说服力.SSCP主要的缺陷是，SSCP是同一个单链DNA碎片形成的许多稳定的结构，这样会在凝胶上出现多个复杂的条带.此外，也有研究表明，在电泳时出现DNA重退火的比率较高，尤其是在分析微生物群落组成比较复杂的样品时.SSCP曾被用于不同的环境中，包括水体土壤和厌氧消化灌中的微生物组成情况等，可是近几年该方法并不常用于微生物群落多样性的研究.

2.4 扩增核糖体DNA限制性分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis ARDRA)

ARDRA 是用PCR扩增经限制酶在特殊位点酶切的16SrRNA片段，然后经电泳将其分离的一种方法.不同的DNA序列会有不同的酶切位点，代表不同群落的序列会出现特殊的泳带.由于该方法简便、快速、廉价已被用于微生物的鉴定和微生物群落多样性的研究中.Fries等人将三氯乙烯作为生物刺激因子，通过用ARDRA方法分析地下水的优势菌群组成及分布情况来确定地下水受苯酚，甲苯和含氯脂肪族化合物的污染情况.Gich 用ARDRA方法分析了工厂污水处理系统里面的活性污泥中微生物群落组成情况，Hohnstock用ARDRA方法分析了受三氯乙烯污染的水体里面的菌群变化情况.Acinas 等曾用这种方法研究了海洋浮游生物随时空变化的情况[8].

在使用该方法时凝胶的着色敏感性较低，这样非优势菌的条带就会丢失，从而丢失系统发育信息.该方法还需要优化限制酶，尤其当序列是未知的情况下，选择合适的限制酶比较困难.因此该技术只能用于研究那些微生物群落较单一的样品中，在阐明具体的系统发育和估算复杂的微生物群落组成时还受到限制，在最近的一些研究中通常将ARDRA和其他的一些方法结合在一起.

2.5 末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)

该方法的原理是用特异性限制性内切酶消化经荧光染料标记的PCR产物，然后将消化产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳分离，最后用荧光检测仪检测标记片段的大小、种类和数量，并用GeneScan软件对结果进行分析.该方法的优点是可以更直观并定量的分析PCR产物.在T-RFLP分析中使用自动检测系统和毛细管电泳，可以提高样品通量，而且在微生物群落分析中结果比其他方法更精确.自Brodie 报道该方法在研究真菌时比DGGE更灵敏后，该方法已被越来越多的应用于微生物群落多样性的分析中.

该技术的不足之处是，T-RFLP仍旧依赖于PCR，而PCR的结果又直接受DNA提取以及扩增引物的影响.使用不同的酶就会造成不同的群落图谱，如果酶解不彻底会造成结果偏高，因此，用该种方法分析微生物群落时，应该至少需要两到四种限制性酶以免结果误差较大.但除了这些不足之处，该技术在研究微生物群落多样性方面有着非常高的应用价值.尤其在研究高通量样品时，不需要检测核算序列，并且灵敏度很高.该方法已经被广泛的应用于食品工业等微生物群落组成比较复杂的样品中，如养鱼场、奶酪加工厂等.

2.6 核糖体间隔分析(Ribosomal intergenic spacer analysis RISA)

RISA是以PCR扩增16SrRNA与23S rRNA之间的间隔区为基础来鉴别微生物种类的一项技术.因为不同种属的间隔区在序列和长度(一般长度在50-1500bp)上都是可变的，经过电泳后，会产生不同的条带，每一个条带至少代表一种微生物.RISA现在也被用于研究微生物群落的多样性.在环境方面，RISA曾被用来检测土壤中可以在低温条件下降解PAH的厌氧的硝酸盐还原菌以及检测淡水中微生物多样性及群落组成情况[9]，也有报道将该方法用于分析食品中的微生物群落多样性.

RISA是一种非常快速简单的方法，但是分析受污染地区的不可培养微生物或者未知的微生物群落组成时该方法就显得不是那么的有效，主要是因为核糖体间隔区序列数据库比较有限.另外，RISA存在的潜在问题是优先扩增较短的模板.在环境应用中，RISA有着较高的序列可变性，一种细菌可能会出现不只一个条带，从而使结果更复杂，高估样品中微生物的多样性.

2.7 高通量测序技术

高通量测序技术被称之为第二代测序技术，可以同时对几百万条DNA分子进行测序.目前在微生物群落分析中应用比较多的是Illumina MiSeq 高通量测序技术.该方法已被应用于土壤、对虾、牛瘤胃、客气等微生物群落的分析中[10-12].该方法不仅可以研究样品中微生物的丰度、分布，还可以研究微生物物种丰度的差异，在研究样品中优势菌群时与DGGE有着一致的结论[13]，目前该方法已经成为研究微生物群落组成时最主要的方法.

3 结束语

以上综述了在研究微生物群落多样性时应用比较广泛的技术，目前还有一些方法如变性高效液相色谱法(DNPLC)和DNA微矩阵等也用于研究微生物群落.免培养方法虽然快速简便，但也存在一定的局限性，如不容易获取环境样品中所有微生物的 DNA、难以精确地确定微生物的分类地位等， 仍有一些菌只能通过培养方法才能检测得到.传统培养分离方法在微生物群落的研究中也是不可或缺的，在微生物种群分类上，可以依靠传统的培养方法做出形态学和生化功能的鉴定.目前的每一种分析方法都有自身的优势和局限性，也都在发展和完善当中，并且各种技术之间也是相互补充相互促进的.

根据以上应用比较广泛的技术看，主要问题还是集中在全面的分析未知样品中微生物群落的多样性，微生物群落的变异也难以测量，辅助试剂对观测体的损害程度也难以准确评估.各技术的相互补充也并没有完全结合上，这也给微生物的研究提出了要求，随着现代科技的进步，高级显微镜及计算机的应用也将为微生物的研究提供强大的技术支持，这也为免培养方法的应用与完善开拓了空间，利用现代科技工具不断完善已有技术的局限点，将会在微生物群落检测方面得到突破.