基于InDel标记的大白菜育种材料分子身份证构建

刘栓桃 张志刚 王荣花 王立华 李巧云 赵智中

（山东省农业科学院蔬菜花卉研究所，国家蔬菜改良中心山东分中心，山东省设施蔬菜生物学重点实验室，山东济南 250100）

大白菜〔Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour）Olsson〕又称结球白菜，属于十字花科芸薹属，在世界范围内广泛栽培，是我国乃至东亚许多国家主要的蔬菜作物之一。我国是大白菜主要起源地，种质资源丰富，山东省又是我国大白菜种质资源最丰富的省份之一，其中沿海地区以合抱类型为主，鲁东南山区和鲁中南山区以叠抱类型为主（谭其猛，1979）。20世纪80～90年代山东省农业科学院蔬菜花卉研究所大白菜课题组张焕家老师收集、保存了大批优质合抱类型与叠抱类型大白菜种质资源，如冠县包头、福山包头、唐王小根、胶县白菜、城阳青、掖县猪嘴、黄县包头等，在此基础上不仅向国家种质资源库提供了大量原始材料，同时也培育了一批享誉国内的优良一代杂种，如山东、鲁白以及牛牌系列大白菜一代杂种，很多品种至今仍广受市场的欢迎。但是，随着农业生态环境的恶化、新的病害（如根肿病）不断涌现，再加之市场对大白菜品种类型的需求呈现个性化、专用化、周年化等趋势，原有的很多品种越来越难以满足市场的需求，急需培育适合不同栽培季节（春、夏、秋）、不同消费需求（熟食、腌制、泡菜等）的抗病、优质大白菜新品种。

优良的育种材料是培育新品种的基础，近10 a来山东省农业科学院蔬菜花卉研究所大白菜课题组在广泛调研市场需求动态和生产中病虫害发生特点的基础上，制定了慎密的种质创新计划。针对原有育种材料在耐抽薹性、抗根肿病等方面的不足，通过广泛收集和引进抗源材料，集成了回交转育、游离小孢子培养和分子标记辅助选择等高效育种手段，系统改良了一批老材料，创制了一批新的育种材料。对育种材料的身份进行鉴定有利于材料的保存、评价和利用。植物材料鉴定的常用方法是利用形态特征进行鉴定，但应用此方法不仅需要鉴定者有丰富的田间识别经验、同时有些形态特征还会受栽培条件和栽培地域的影响。另外，不同的鉴定者对相同的特征也存在识别方面的差异，因此基于形态特征描述的种质材料鉴定不利于种质材料的保存、交流以及信息化管理，而利用分子标记对种质材料进行鉴定则不受这些因素的限制。目前研究者利用SSR、RAPD、SRAP等分子标记构建出了大豆（唐玉娟 等，2016）、水稻（陆徐忠 等，2014）、苹果（高源 等，2015）、梨（薛华柏 等，2018）、红麻（郑海燕，2010）、萝卜（邱杨 等，2014）等农作物的分子身份证。在上述研究中，关于分子身份证构建过程使用标记的数量、标记检测结果的赋值均没有统一标准，另外用于分子身份证构建的标记只能鉴定少量的植物材料，如果再增加或发现新的植物材料，还需要再开发新的标记才能构建新材料的分子身份证，即已经开发的标记兼容性不足。为了解决上述问题，本试验在前期工作积累的基础上，从每条染色体上选择2个InDel标记，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对105份大白菜育种材料进行鉴定。采用二进制数据为标记检测结果赋值、结合标记缺失和加倍等特殊情况下的字母赋值结果，构建这些材料的分子身份证。本试验所选InDel标记可以实现标记检测结果赋值的标准化、所选标记数量也足以满足大白菜新增资源分子身份证的构建。试验结果可以为大白菜分子身份证的标准化管理和信息化管理提供借鉴，构建的105份育种材料的分子身份证可以为大白菜育种材料鉴定、育成品种的鉴定提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为山东省农业科学院蔬菜花卉研究所大白菜课题组收集和创制的育种材料105份（表1），主要包括本课题组自20世纪70年代以来从国内收集的地方品种的优良自交后代、部分优良品种的亲本材料以及近10 a来利用收集的优良品种自交纯化、回交转育的纯系。

试验于2017年春季在国家蔬菜改良中心山东分中心和山东省设施蔬菜生物学重点实验室进行，每份材料分别取10～20粒种子，直播于10 cm×10 cm的花盆内，待出苗后取真叶液氮速冻，置于超低温冰箱中-80 ℃保存备用。

1.2 基因组DNA提取

DNA提取参考刘栓桃等（2014）的方法，即取约100 mg冷冻保存的真叶组织置于2 mL螺口研磨管中，加入800 μL 65 ℃预热的TPS试剂（100 mmol·L-1Tris-HCl，1 mol·L-1KCl，10 mmol·L-1EDTA，200 mg·L-1RNA酶，pH=8.0）和3～4粒直径5 mm的陶瓷研磨珠，于自动研磨仪（法国，Precellys24）上5 000 r·min-1振荡研磨30 s；匀浆于65 ℃温箱或水浴锅内保温30 min；待匀浆凉至室温后10 000 r·min-1离心10 min；将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，加入等体积氯仿并小心混匀，12 000 r·min-1、4 ℃离心10 min；将上清液再次转移至新的1.5 mL离心管中，并加入等体积异丙醇小心混匀，室温下使DNA沉淀5 min；于4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min，弃上清液；加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，7 500 r·min-1离心1 min，弃上清液后于室温短暂干燥DNA；加入100 μL 10 mmol·L-1Tris-HCl（pH=8.0），4 ℃过夜以溶解基因组DNA；第2天取出，3 000 r·min-1离心1 min后将上清液转移至新的离心管中。利用UltroSpec 3300 pro（GE Healthcare）分光光度计测定DNA浓度，将基因组DNA浓度稀释至50 ng·μL-1，于-20℃冰箱保存备用。

1.3 引物筛选与合成

从前期鉴定的593对InDel标记中进行引物筛选（张志刚 等，2016），选择标准在参考刘栓桃等（2018）的基础上，进一步考虑下列因素：① 每条染色体上各选2对引物，且2对引物尽可能位于染色体的不同臂上；② 每对引物所能检测到的等位基因频率为2、即最多可以扩增出2条条带；③所选引物尽可能从90%以上的材料中都能扩增出条带；④ 引物所能检测到的主要等位基因频率介于0.5～0.8之间。基于上述标准，所选引物编号及序列如表2所示，引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 PCR扩增及产物检测

PCR扩增采用天根生物科技（北京）有限公司 的 2×Taq Plus PCR MasterMix（KT205-01），25 μL反应体系为：2×Taq Plus PCR MasterMix 12.5 μL，10 pmol正、反向引物各1 μL，模板（50 ng·μL-1）1 μL，去离子水9.5 μL。PCR扩增在Bio-Rad T100TM梯度PCR仪（美国Bio-Rad公司生产）上进行，扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94℃变性10 s，58.5 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，35次循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以50 bp ladder作为DNA分子量标准，银染显色，智能手机拍照。

表1 供试大白菜材料的主要特征

表2 引物信息

1.5 数据处理

将电泳图谱的照片在UVP GelDot IT300凝胶成像仪上转换成tif格式，利用Vision Works LS软件将100～200 bp范围内清晰可见的条带按照下列方法赋值：如果某样本扩增产物为单一的相对迁移率较大的条带则赋值0，单一的相对迁移率较小的条带则赋值1。对于扩增结果为缺失或杂合现象的样品，取10个单株材料分别提取DNA进行校准，只有10个单株都为缺失或杂合型的才确定其基因型为缺失型（w）或加倍型（H），否则以高代自交系的单一扩增结果为准。

1.6 分子身份证构建

在Excel中，将表2所列的引物按照从A01～A10的顺序，从左到右排列，相同染色体上的引物则依据重测序检测的物理位置顺序从小到大排列。按照1.5的赋值方法对所有材料的20对引物检测结果赋值，构建原始数据矩阵。将某材料检测结果赋值的20位数码按顺序合并在一个单元格内，构建育种材料的分子身份证。

2 结果与分析

2.1 核心引物的扩增结果

图1 引物A0402和A0501在部分大白菜材料中的扩增结果

20对InDel引物从105份参试大白菜材料中共扩增出40个多态性位点，每对引物都按照预期扩增出了2个多态性位点。其中有16对引物从供试105份材料中均分别扩增出了单一条带。经过校准，发现有2对引物的扩增产物存在缺失现象，即没有任何条带被扩增，这2对引物分别是A0402和A0901，前者从11份材料中缺失、后者从7份材料中缺失；同时有2对引物（A0501和A0701）的检测结果呈加倍现象，即同时扩增出2条条带，分别有10份和11份材料发生加倍，A0402和A0501在部分材料中的扩增结果见图1。

2.2 大白菜育种材料分子身份证构建

参试105份大白菜材料的分子身份证见表3，该身份证由20位数码组成，将所有数据在Excel表格中进行排序，没有发现重复数据。如果去掉有缺失和加倍现象的4个标记，则所得的16位二进制数码也没有发现完全相同的数据。

表3 参试105份大白菜材料的分子身份证

3 结论与讨论

植物的分子身份证技术是随着分子标记技术的发展而产生的一种分子鉴定技术，主要是因为分子标记检测不受环境条件、表型、植物组织、生长发育阶段等的影响，为准确、可靠地鉴定植物品种的首选手段之一，同时对品种权保护也具有重要的意义（胡振帮 等，2016）。分子身份证构建一般遵循简约性和唯一性原则，它由一组数码（数字或数字与字母组合）按顺序排列而成，这就涉及对分子标记检测产物编码赋值的问题。由于分子标记的种类比较多，各物种分子标记开发的程度不同，导致植物分子身份证构建时对标记的编码规则和数码长短没有统一标准，因而难以实现标准化、信息化管理。如辜大川等（2012）采用24对SSR引物构建的水稻分子身份证包含85位二进制数值或25～26位十进制数值。同样是水稻，陆徐忠等（2014）则利用12个水稻SSR标记（每条染色体1个），将SSR扩增的DNA指纹、水稻品种的基本商品信息和特异基因信息等3部分内容考虑在内，构建的水稻品种分子身份证包含40位数码（数字和字母组合）。以大豆为例，丁俊杰等（2012）构建的大豆分子身份证包含7位十进制数据，而唐玉娟等（2016）构建的大豆分子身份证包含5位十进制数据。类似的现象不胜枚举，主要原因有以下几个方面：首先是针对不同的材料筛选到的可用标记不同，其次是对标记的赋值方式不同（有的研究者用0、1等二进制数据赋值，有的研究者根据多态性条带的数目以0～9十进制数据赋值），第三是对数码型身份证的位数没有统一规定，第四是所用标记没有考虑对同一物种不同品种或品系的兼容性。这就导致同一物种不同的实验室可能给出不同的身份证编码，或者在增加新的品种或品系时，构建其分子身份证时还需要再开发新的标记。前者违背了“身份证”这一概念中有关唯一性的宗旨，导致不同实验室之间的数据难以比较和共享；后者在一定程度上限制了这项技术的推广和应用。

在构建植物分子身份证的探索研究中，标记的选择至关重要。早期的研究者多使用SSR标记（陆徐忠 等，2014；唐玉娟 等，2016；徐安然 等，2017；万映伶，2018；薛华柏 等，2018），但SSR标记的多态性过于丰富，它在一定数量的物种群体内产生的多态性位点远大于2，如李国强（2008）和杨金雪（2013）用SSR标记检测大白菜种质资源，最多的1对引物有10～12个多态性位点，平均则可以产生4.00～5.16个。用于水稻（辜大川等，2012；陆徐忠 等，2014）、大豆（丁俊杰 等，2012；唐玉娟 等，2016）等植物品种或资源分子身份证构建的SSR标记所产生的多态性位点也远大于2个。欲使植物分子身份证构建技术标准化，有必要开发新型的便于标准化赋值的分子标记。而基于全基因组重测序技术所开发的InDel标记可以满足上述需求。InDel标记的开发过程完全基于全基因组重测序发现的序列差异，与其他分子标记相比，基因组同一位点发生不同长度大小InDel突变的几率较小，已有研究证明多数InDel标记仅产生2个多态性位点，超过2个多态性位点的InDel标记在基因组中占比较少（朱东旭 等，2014；魏利斌 等，2017；刘栓桃 等，2018）。由于InDel标记的开发完全基于测序信息，就1对引物而言，其产生的2个多态性位点序列和长短完全是已知的，有利于标记的标准化赋值。

本试验从大白菜基因组的10条染色体上各选2对（每个染色体臂上各包含1对）反复验证的InDel标记引物（张志刚 等，2016；刘栓桃 等，2017，2018），每对标记引物在大白菜材料中仅能检测出2个多态性位点（刘栓桃 等，2018），因此便于采用二进制数据对PCR扩增产物进行赋值，对于缺失和加倍型则用字母赋值，构建了105份大白菜材料的分子身份证，该身份证包含20位数码。在所选的20对引物中，有16对引物从大白菜育种材料中均分别扩增出了单一的条带，表明这些标记在大白菜自交系中具有唯一呈现性特点。另外，有2对引物的扩增产物从少数材料中缺失，这可能是相应标记所在的染色体片段缺失所致；同时，也有2对引物在少数材料中呈共显性特点，这种共显性呈现的标记亦可能是所在的染色体片段局部加倍造成的，因为染色体片段的局部缺失或加倍现象是遗传变异的一种常见现象（Cheng et al.，2013）。因为缺失型和加倍型的标记必须经过单株验证才能确定标记的检测结果，这使得相应材料的分子身份证构建过程更加复杂、成本也相应地增加，所以在今后的工作中，应在上述缺失型和加倍型标记所在的染色体区域再筛选和开发具有唯一呈现性的标记引物，对大白菜分子身份证进行修正，这样得到的大白菜分子身份证将都是二进制数码，便于利用计算机对分子身份证数据库进行管理。但就本试验而言，即使淘汰这4对引物，产生的16位二进制数码也足以将105份材料完全区分开。另外，本试验筛选的20对引物具有较强的兼容性，因为理论上讲20对标记所能容纳的分子身份证数量将是220，即可以鉴定1 048 576份大白菜材料，因此这些标记引物的开发对新创制材料分子身份证构建具有通用性，有利于更多大白菜种质资源分子身份证的构建，同时也适用于杂交种分子身份证构建，从而为品种权维权提供技术鉴定依据。

综上所述，本试验筛选到的仅能扩增出2个多态性位点的InDel标记有利于分子标记检测结果的赋值标准化，不仅适合现有大白菜育种材料的分子身份证构建，同时也适合更多大白菜新种质以及大白菜杂交种的分子身份证构建。旨在为植物分子身份证技术的规范和标准化管理提供参考和借鉴，为大白菜品种权维权提供技术鉴定依据。