黄瓜体细胞胚途径再生体系的建立及优化

冯 琴 魏文霞 董翔宇 张婷婷 杨玉婷 陈书霞

（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100）

黄瓜（Cucumis sativus L.）作为设施蔬菜栽培中常见种类，在生产过程中常受到各种病虫害及连作障碍的困扰（朱宗源 等，2000；杨建霞，2005），导致产量和品质受到严重影响（贺丽娜 等，2008；何莉莉 等，2010）。由于黄瓜遗传基础狭窄（Staub et al.，2005；张圣平 等，2010；闻小霞 等，2014），传统的常规育种存在转育效率低、育种周期长且可利用的抗性资源少的问题（刘丽英 等，2006；许娜和储俊，2008；段莉莉 等，2018），重要农艺性状基因的功能验证与快速转育也面临着巨大的挑战。因此，利用基因工程技术进行种质改良不失为一条有效途径（王烨 等，2014），同时也为近年来大量发掘与克隆的重要基因功能解析奠定了坚实的基础。

自2006年以来，研究者对黄瓜的组织培养和遗传转化进行了很多探索（李建欣，2006；张圣平 等，2010；黄东梅 等，2012；李蕾 等，2015）。在组织培养方面，主要通过原生质体途径、体细胞胚途径和离体器官再生途径进行黄瓜再生体系的探索（陈继峰，2007），主要是针对基因型（刘艳，2016）、苗龄（Kantharajah & Dodd，1990；张兴国和刘佩瑛，1998）、外植体前处理（李艳华，2016）、外植体类型（Colijn-Hooymans et al.，1994；刘玉霞 等，2014）、激素种类和浓度（Punja et al.，1990）对诱导黄瓜植株再生的因素进行了探究，但在黄瓜的遗传转化效率上，依旧存在转化率低、假阳性高、嵌合体多等方面的问题（黄东梅 等，2012；安亚伟，2013；李胜男，2016；段莉莉 等，2018；秦智伟 等，2018；赵子瑶，2018）。虽然一些研究者在黄瓜单倍体诱导方面进行了探索，但再生频率没有明显提高（张圣平 等，2010；王烨 等，2015）。因此，在器官再生基础上发展起来的黄瓜转基因技术不够完善，转化效率普遍较低，当前进行基因功能的遗传转化研究还远远不够。

利用体细胞胚发生途径进行遗传转化具有很多优点，体细胞胚具有与合子胚相似的结构，繁殖速度快且易接受外源DNA的插入（胡适宜，1982），并且一个成熟的体细胞再生体系通常具有很高的再生效率。因此能否通过体细胞胚发生途径建立一种高频的再生体系，提高黄瓜遗传转化效率是关系到黄瓜外源基因能否高效导入的重要技术问题，也是对大量挖掘到的重要农艺性状基因进行功能验证的主要途径。黄瓜体细胞胚发生受基因型、外植体类型和激素浓度等因素的影响（Cade et al.，1990；余阳俊和朱其杰，1992；Kim et al.，2008），尽管高浓度的2，4-D能够促使胚性愈伤的形成，子叶节被认为是最佳外植体，但体细胞胚的诱导受基因型的影响非常显著（Kuijpers et al.，1996；杨爱馥 等，2003；魏文霞 等，2019），目前仅限部分基因型可以诱导。本试验拟通过对4个不同基因型黄瓜种质、不同外植体类型和培养基激素组成进行筛选，建立黄瓜体细胞胚再生体系并进行优化，为进一步的黄瓜遗传转化研究提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用的黄瓜种质华北型8681和DB、华南型D4和9101均为西北农林科技大学园艺学院黄瓜课题组保存的高代自交系材料。试验于2016年10月至2017年12月在西北农林科技大学园艺学院公共实验平台进行。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗的获得 挑选饱满的黄瓜种子，流水冲洗后，在超净工作台中，首先用75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗3～4次，然后再用5% NaClO消毒10 min，无菌水冲洗3～4次，最后浸泡4 h，无菌滤纸吸干表面水分，接种到MS培养基上，置于培养室中，培养室温度22 ℃，光照条件1 200 μmol·m-2·s-1，光照时间 16 h·d-1。

1.2.2 不同外植体的获得 子叶节：培养无菌苗生长至子叶展开，用无菌手术刀切除下胚轴及其以下部位，切除2/3子叶远端部分，获得子叶节外植体。子叶：将子叶切成靠近叶柄的近生长点段（占子叶的1/3）、中间段（占子叶的1/3）和子叶尖端（占子叶的1/3）。下胚轴：切除黄瓜无菌苗的子叶和根部，将下胚轴切成1 cm左右的小段，每株苗可获得2个外植体。

1.2.3 激素组合 激素组合见表1，其中A、B、C分 别 代 表 2，4-二 氯 苯 氧 乙 酸（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）、N6- 呋 喃甲基腺嘌呤（kinetin，KT）和6-苄氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）的浓度，与编号对应的是浓度，如A1表示2，4-D的浓度为0 mg·L-1，B2表示KT浓度为0.1 mg·L-1，A1B2激素组合表示在培养基中添加的2，4-D浓度为0 mg·L-1，KT浓度为0.1 mg·L-1。对不同基因型黄瓜进行愈伤组织和体细胞胚诱导时仅使用A和B的激素组合。

1.2.4 愈伤组织的诱导 愈伤组织诱导的基础培养基为MS培养基，添加不同浓度的2，4-D（A）、KT（B） 和 6-BA（C）， 蔗 糖 30 g·L-1， 琼 脂 7 g·L-1，调节pH至5.8，高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌21 min。将外植体背面朝下，接种至诱导培养基，每瓶含6个外植体，每个处理3次重复。培养21 d后统计愈伤组织的产生情况（愈伤组织诱导率=长出愈伤的外植体数/总外植体数×100%）并记录。培养温度22 ℃，光照强度为1 200 μmol·m-2·s-1，光照时间16 h·d-1。暗培养处理是以子叶节为外植体，在诱导起始阶段进行7 d的黑暗处理，接着进行光照培养，光照时间16 h·d-1，以诱导培养基上一直进行光照培养的子叶节为对照。

表1 培养基的不同激素处理及编号 mg·L-1

1.2.5 胚状体的诱导 分化培养基为MS基础培养基，添加不同浓度的2，4-D、KT和6-BA，蔗糖30 g·L-1，琼脂7 g·L-1，调节pH至5.8，高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌21 min。将产生的愈伤组织接种至分化培养基中，每瓶6块，培养20～35 d后统计出胚率（出胚率=出胚愈伤块数/总愈伤块数×100%）并记录。

1.2.6 体细胞胚的细胞形态学观察 将在分化培养基中形成的胚性愈伤组织，取不同发育时期的体细胞胚置于含MS培养基的培养皿中，用体视荧光显微镜（MZ10F，徕卡，德国）进行形态学观察。

1.2.7 体细胞胚植株再生及炼苗移栽 将成熟的胚转移至MS培养基上，培养至萌发成具有生长点的正常小植株时，逐渐打开瓶口，7 d后移栽至基质中。

2 结果与分析

2.1 不同基因型对愈伤组织诱导率和出胚率的影响

将子叶节接种在愈伤诱导培养基7 d后，可见外植体上切口处有愈伤形成，随着时间的增加愈伤组织也明显增加。但不同基因型对愈伤组织的诱导率不同。4种基因型中，8681和DB的愈伤诱导率分别在27.78%～100.00%及22.22%～94.44%之间（表2）。而D4和9101的愈伤诱导率较稳定，平均诱导率分别为73.61%和80.83%；其中，9101的愈伤诱导率较高，且诱导的愈伤松散、质地疏松，颜色嫩黄色。

将愈伤组织接种至分化培养基中，14 d后可萌发出胚，在此阶段4种基因型的出胚率差异明显（表3）。在分化培养基上培养14 d，未观察到8681和DB有胚出现，D4和9101形成了一定数量的胚。9101形成的体细胞胚较正常，出胚率较高。而D4出胚率低，畸形胚较多。因此，后续试验皆以9101种质为试验材料。

表2 诱导培养基中不同基因型对愈伤组织诱导率的影响

表3 分化培养基中不同基因型对出胚率的影响

2.2 不同激素配比对愈伤组织诱导率和出胚率的影响

生长素和细胞分裂素对黄瓜愈伤组织的诱导和胚状体的产生都具有一定的影响。将外植体接种至诱导培养基中，7 d左右可见外植体膨大，且在切口处有愈伤形成。由表4可以看出，添加2，4-D与不同浓度的KT和6-BA都能够诱导愈伤组织形成，2，4-D浓度较低时愈伤数量较少，伴有不定根产生，随着浓度的增加其愈伤组织形成的数量越多，2，4-D 浓度为 1.50 mg·L-1或 2.00 mg·L-1时愈伤诱导率分别达97.92%和100.00%，并且形成的嫩黄色愈伤组织质地疏松，量较多。添加KT或6-BA后愈伤诱导率呈降低趋势，特别是添加6-BA的培养基中愈伤组织的形成受到了一定的抑制。因此添加浓度为1.50 mg·L-1或2.00 mg·L-12，4-D的MS培养基为较适宜的诱导培养基。

表4 诱导培养基中不同激素浓度对愈伤组织诱导率的影响

将胚性愈伤组织转至分化培养基，约14 d可观察到萌发的成簇状胚状体，不同浓度激素的培养基出胚率差异较大，总的看来，添加KT的2，4-D培养基都能诱导出胚。虽然大部分添加6-BA的2，4-D培养基也能够诱导出胚，但发育成正常苗的数量较少，得到的植株大多为畸形苗（表5）。在添加0.10 mg·L-12，4-D和0.5 mg·L-1KT的分化培养基中出胚率可达33.33%，且获得正常植株12株，明显高于其他激素组合。因此，9101较适宜的出胚培养基为MS+0.10 mg·L-12，4-D + 0.5 mg·L-1KT。

2.3 暗培养对愈伤组织诱导率和出胚率的影响

以子叶节为外植体，暗培养的处理中愈伤组织诱导率为94.44%，远高于光照处理。暗培养条件下诱导出的愈伤质地更为疏松，呈颗粒状（表6）。将暗培养诱导出的愈伤组织转接到分化培养基后，其出胚率也高于光照下的25.71%，达36.47%。由暗培养诱导的愈伤而获得的正常植株数量也较光照下的多了1倍多。因此，愈伤组织诱导阶段暗培养对于出胚和正常植株的形成较为有利。

2.4 不同外植体对愈伤组织诱导率及出胚率的影响

将外植体放入含2.00 mg·L-12，4-D的诱导培养基中，黄瓜幼苗不同外植体的愈伤组织诱导率不同，愈伤的生长状态也不同，且影响到胚的正常萌发。由子叶节诱导的愈伤组织质地更疏松，且多为颗粒状，由近生长点段子叶、中间段子叶和子叶尖端诱导而得到的愈伤组织结构更为紧致（表7）。子叶节和子叶尖端都能够形成大量的愈伤组织，后者虽能出少量胚，但大多畸形，不具有正常成苗能力，而由子叶节诱导而来的愈伤组织更容易在分化培养基中出胚，并形成正常植株。

表5 分化培养基中不同激素浓度对出胚率的影响

2.5 胚状体发育及植株再生

从图1可明显看出，黄瓜胚状体形成和发育过程包含球形胚（A）、心形胚（B）、鱼雷形胚（C）和子叶胚（D）4个时期。后期（E、F）子叶和胚根分化出来。与母体分离且结构完整的胚状体发育为成熟胚，萌发成苗，最终获得完整植株。以黄瓜子叶节为外植体的胚状体发育及植株再生过程见图2。

图1 9101子叶节所出胚状体的不同生长阶段

图2 华南型黄瓜9101的植株再生过程

表6 光暗条件对9101愈伤组织诱导率和出胚率的影响

表7 不同外植体部位对9101愈伤组织诱导率和出胚率的影响

3 结论与讨论

3.1 不同基因型对体细胞胚形成的影响

植物体细胞胚的形成和发育易受到基因型、激素水平、暗条件等因素的影响。同一科属的不同植物体材料其成胚的能力也不同（袁澍 等，2003），Oláh等（2009）对59种基因型的葡萄材料进行诱导，有29种无法通过体细胞胚途径完成再生。杨爱馥等（2003）用3种不同的黄瓜种质叶三旱、长春密刺和老来少诱导体细胞胚，只有华南型黄瓜叶三旱诱导出体细胞胚。本试验选用了4种基因型黄瓜种质，仅华南型黄瓜9101和D4能成功诱导出胚状体，这也说明了基因型差异是影响胚状体形成和发育的重要因素。此外，张若纬等（2009）比较了8种类型的黄瓜自交系材料再生频率的差异，发现华南型黄瓜品种四川白瓜再生频率高于华北型黄瓜，黄瓜体细胞成胚及再生能力可能与不同生态型种质有关，华南型黄瓜是体细胞胚发生较为理想的材料。

3.2 不同培养条件对体细胞胚形成的影响

有研究认为培养初期的暗培养处理有利于黄瓜子叶节的分化再生（王烨 等，2011），本试验也证实了这一点，这可能跟黑暗条件下植物体内某些酶的合成有关。大量的研究表明2，4-D能够促进胚状体形成（陈小鹏 等，2005；王璐 等，2008），因此在体细胞胚诱导过程中2，4-D的应用较为广泛。Kuijpers等（1996）研究发现，在诱导培养初期提高2，4-D的浓度能够促进胚性愈伤组织的形成，在胚状体形成阶段仅需较低的2，4-D浓度即可，在胚状体发育阶段则不需要2，4-D。本试验愈伤组织诱导阶段，随着2，4-D浓度的增加其愈伤诱导率也上升，愈伤组织呈嫩黄色，质地疏松，生长状态较好，添加浓度为2.00 mg·L-12，4-D的培养基愈伤诱导率最高可达100.00%，而分化培养阶段2，4-D浓度在0.15 mg·L-1以下时有利于胚状体的形成，在未添加激素的普通MS培养基上胚状体生长发育，最终形成完整的植株。Masuda等（1995）认为，在愈伤组织诱导及胚性细胞形成的过程中生长素起决定性作用，细胞分裂素的加入会影响愈伤组织和体细胞胚的发生。本试验中与仅添加2，4-D相比，添加KT 和6-BA的培养基中愈伤诱导率呈下降趋势。在添加0.10 mg·L-12，4-D和0.5 mg·L-1KT的分化培养基中出胚率可达33.33%，且获得正常植株12 株，明显高于其他激素组合。在含2，4-D的分化培养基中添加6-BA，与添加KT相比，虽然也能够诱导出胚，但发育成正常苗的数量较少，畸形苗居多。

3.3 不同组织部位对体细胞胚形成的影响

有报道表明，黄瓜子叶（Ziv & Gadasi，1986；Chee，1990）、初生叶（Chee & Tricoli，1988）、未成熟的合子胚（Kim & Janik，1989）、下胚轴（Chee，1990）、原生质体（张兴国和刘佩瑛，1998）、子叶节（余阳俊和朱其杰，1992）等外植体均能诱导出体细胞胚。本试验中不同类型的外植体出胚率差异较大，子叶节的出胚率最高，且是唯一获得正常再生植株的外植体，这种差异可能是由于子叶节具有某种特殊的细胞或组织（谷安根和王立军，1997），能够在外源激素的刺激下发生脱分化形成具有胚性的细胞，进而分化成完整植株。因此，子叶节是愈伤诱导和体细胞胚形成的最佳外植体。

本试验成功诱导出了体细胞胚并萌发成苗，但不正常胚和畸形苗出现的情况比较严重，这类问题在魏文霞等（2019）的研究中也出现过，可能是由于在愈伤组织诱导或分化培养过程中2，4-D和KT的浓度过高导致的，如何减少不正常胚形成和畸形苗出现的频率，还有待进一步研究。