氧化应激与慢性鼻窦炎和鼻息肉发病的相关性研究*

吴敏曼 黄春江 施志强 张玲 普合菊

1云南中医药大学第一附属医院（云南昆明，650021）

我们前期慢性鼻窦炎、鼻息肉和正常鼻黏膜组织间差异蛋白质组学研究中发现了4个与氧化应激有关的蛋白质Cu/ZnSOD、DJ-1蛋白、谷胱苷肽S转移酶-pi和自然杀伤细胞促进因子B（NKEF-B）在慢性鼻窦炎组织中表达最高，而在鼻息肉组织中表达最低[1]。并通过免疫组化实验观察Cu/ZnSOD在慢性鼻窦炎和鼻息肉组织中的定位表达[2]。在本次实验中，我们打算采用免疫组化实验并扩大标本量来观察DJ-1蛋白、谷胱苷肽S转移酶-pi和自然杀伤细胞促进因子B（NKEF-B）在慢性鼻窦炎、鼻息肉和正常鼻黏膜组织之间的表达情况。以了解氧化应激与慢性鼻窦炎和鼻息肉发病的相关性。

资料与方法

1 收集病例

收集慢性鼻窦炎鼻息肉临床病例74例，根据临床表现、CT扫描、病理诊断和随访观察情况将病例分为两组：不伴鼻息肉慢性鼻-鼻窦炎（CRSsNP）38例，伴有鼻息肉慢性鼻-鼻窦炎（CRSwNP）36例。收集正常对照组18例。所有病例均通过医院伦理委员会审议。

①纳入标准：年龄18～65岁，无严重器质性疾病（如心脏病、高血压、糖尿病、肾病和结缔组织病）。参照《慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南（2012年，昆明）》选择病例。术前2周均未用糖皮质激素、抗生素及抗组胺药。正常对照组鼻黏膜组织取自单纯鼻中隔偏曲患者的中鼻甲黏膜。

②排除标准：排除慢性真菌鼻窦炎、鼻腔乳头状瘤、急性鼻-鼻窦炎及伴有鼻腔鼻窦恶性肿瘤者、免疫功能缺陷者、原发性纤毛运动功能障碍和囊性纤维化等疾病。

2 主要实验试剂及仪器

①SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、苏木素复染液-北京博奥森生物技术有限公司；

②兔抗DJ-1蛋白、兔抗谷胱苷肽S转移酶-pi和兔抗自然杀伤细胞促进因子B（NKEF-B）多克隆抗体-北京博奥森生物技术有限公司；

③Olympus BX51型光学显微镜-日本产。

3 免疫组织化学法检测DJ-1蛋白、谷胱苷肽S转移酶-pi和自然杀伤细胞促进因子B（NKEF-B）

取石蜡块连续切片，厚度4um，采用免疫组化SP法进行（参照说明书进行实验）。

4 图像分析

切片采用Olympus BX51型显微镜在低倍镜（×200）下观察，染色强度分级如下：阴性(－)：无阳性细胞；弱阳性(＋)：阳性细胞比例≤25%；中等阳性(＋＋)：阳性细胞比例为 26%～50%；强阳性(＋＋＋)：阳性细胞比例≥50%。

5 统计学分析

SPSS 15.0统计软件：多个构成比的χ2检验统计分析慢性鼻窦炎、鼻息肉和正常鼻黏膜组织之间DJ-1蛋白、谷胱苷肽S转移酶-pi和NKEF-B阳性细胞构成比有无差异。

结果

1 染色结果

我们采用免疫组化试验并扩大标本量来验证DJ-1蛋白、谷胱苷肽S转移酶-pi和NKEF-B在慢性鼻窦炎、鼻息肉和正常鼻黏膜组织之间的差异表达并观察在组织中的定位情况。发现DJ-1阳性细胞是以胞浆或者胞核出现棕黄色染色，主要位于黏膜上皮及腺上皮（图1A、B、C）。

发现谷胱苷肽S转移酶-pi阳性细胞是以胞浆或者胞核出现棕黄色染色，主要位于黏膜上皮及腺上皮（图 2A、B、C）。

发现自然杀伤细胞促进因子B（NKEF-B）阳性细胞是以胞浆或者胞核出现棕黄色染色，主要位于黏膜上皮及腺上皮（图3A、B、C）。

2 统计分析结果

我们发现DJ-1蛋白、谷胱苷肽S转移酶-pi和NKEF-B在同一个组织标本中的定位和表达强度是一致的。它们主要表达于黏膜上皮和腺上皮，χ2检验统计分析慢性鼻窦炎、鼻息肉和正常鼻黏膜组织之间DJ-1蛋白、谷胱苷肽S转移酶-pi和NKEF-B阳性强度构成比是有显著性差异的（χ2=46.053，P＜0.01)。慢性鼻窦炎组织的阳性强度以“+++”为主（图1.A和图2.A和图3.A)，鼻息肉组织的阳性强度以“+”为主（图1.B和图2.B和图3.B），正常鼻黏膜组织的阳性强度以“++”为主（图1.C和图2.C和图3.C）。慢性鼻窦炎、鼻息肉和正常鼻黏膜组织之间DJ-1蛋白、谷胱苷肽S转移酶-pi和NKEF-B阳性强度的比较，见表1。

表1 慢性鼻窦炎、鼻息肉和正常鼻黏膜组织之间DJ-1蛋白、光胱苷肽S转移酶-pi和NKEF-B阳性强度的比较

讨论

氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量以氧自由基为主的氧化中间产物，这是导致衰老和疾病的一个重要因素。氧化应激和炎症是紧密相连的[3-6]。Uneri C等[7-10]发现鼻息肉组织中氧自由基含量较高，因此指出氧自由基损害与鼻息肉的发病有关。正常生理条件下，机体具备完善的抗氧化防御机制。我们前期慢性鼻窦炎和鼻息肉组织的差异蛋白质组学研究发现了4个抗氧化有关的蛋白质：超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD）、DJ-1蛋白、谷胱苷肽S转移酶-pi和自然杀伤细胞促进因子B（NKEF-B）在慢性鼻窦炎和鼻息肉组织中差异表达。并通过免疫组化实验发现CuZnSOD定位于鼻黏膜上皮、腺上皮和杯状细胞中，是鼻黏膜局部抗氧化防御机制的重要成分。

DJ-1蛋白通过清除活性氧而清除由氧化应激引起的蛋白质氧化，用反义DJ-1敲除内源性DJ-1基因，可使细胞易受氧化损伤。DJ-1蛋白通过增加限速酶-谷氨酸半胱氨酸连接酶的活性而增加了细胞内谷胱甘肽的水平，减少了由氧化应激引起的蛋白质氧化，从而改善细胞存活[11]。

谷胱苷肽S转移酶-pi是一种抗氧化物酶，能抵抗氧化应激，并发挥细胞内解毒作用。慢性炎症迁延不愈或反复发作与炎性细胞产生活性氧有关，活性氧是许多细胞信号转导通路中的第二信使，这些细胞信号转导通路与细胞增生、分化和凋亡有关[12]。谷光苷肽S转移酶-pi可通过清除活性氧而发挥抗炎作用。

自然杀伤细胞促进因子B（NKEF-B）（亦称Peroxiredoxin 2硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ）能够增强自然杀伤细胞活性，此外它是一种抗氧化蛋白，能保护细胞免受氧化应激和化学成分的损伤；能清除新陈代谢过程中产生的过氧化物[13]。

本次研究中我们观察到DJ-1蛋白、谷胱苷肽S转移酶-pi和自然杀伤细胞促进因子B（NKEF-B）也表达于鼻黏膜上皮、腺上皮和杯状细胞中。它们在慢性鼻窦炎组织中表达最高，而在鼻息肉组织标本中表达较低，可以推测当鼻黏膜抗氧化应激能力减弱或先天缺陷，氧自由基清除减少，导致慢性炎症可能迁延不愈或转化为鼻息肉。因此氧化应激损伤与慢性鼻窦炎和鼻息肉发生、发展和炎症迁延密切相关。抗氧化蛋白在慢性鼻窦炎中的高表达与鼻息肉中的低表达恰好从病理生理学上佐证了临床上二者虽然常常伴随发生，但二者可能是不同疾病或是同一疾病的不同发展阶段。抗氧化蛋白的差异表达对慢性鼻窦炎及鼻息肉的发病及预后有着重要的作用。此外，研究和开发高效无毒的氧自由基清除剂特别是天然抗氧化剂对于治疗慢性鼻窦炎和鼻息肉等炎症性疾病也具有重要的应用价值[14]。