骨髓间充质干细胞修饰治疗急性肝功能衰竭的研究进展

陈笑艳，王经琳，施晓雷

（1.东南大学医院 外科，江苏 南京 210018；2.南京大学医学院附属鼓楼医院 肝胆外科，江苏 南京210008）

我国是肝病高发国家，各种肝病引起的急、慢性肝功能衰竭患者病情凶险、进展迅速、预后较差，内科药物治疗病死率高达50%～80%[1]。急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）是由多种病因导致的突发、严重的肝损伤，伴有大量肝细胞功能障碍，可表现为严重的肝性脑病、凝血功能障碍、黄疸和进行性多器官功能衰竭。因此，ALF的治疗一直是临床上亟待解决的难题。肝移植是治疗ALF最确切的手段，但临床应用受到了供体短缺、手术费用高昂、术后需要长期服用免疫抑制剂等原因的限制，临床上仅有很少一部分患者实施肝移植治疗。干细胞移植近年来发展迅速，因其移植简单，对受体的影响小，价格相对较低，成为继肝移植后又一治疗ALF的有效手段[2]。目前，细胞移植治疗ALF的种子细胞包括肝细胞、造血干细胞、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSs）等[3-4]。MSCs因其来源丰富、增殖能力强、没有伦理制约，是细胞移植中最理想的细胞来源[5]。因此，MSCs移植治疗ALF成为研究的热点[6]。MSCs通过免疫调节可以促血管生成[7]、抗凋亡[8]和抗氧化[9]。研究发现，MSCs在肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等肝脏疾病的治疗具有良好的效果[10]。

虽然干细胞疗法已经取得了一定的进展，但针对这些临床研究的系统评价发现：目前已有的干细胞移植仅能改善患者部分肝功能指标，并且对于患者的生存期并无显著影响[11]。在MSCs移植过程中，由于移植干细胞对损伤部位的严重氧化和炎症应激的抵抗力不足造成只有少数细胞可以迁移到受损组织，移植后低细胞存活率显著降低了其治疗效果[12]。尽管目前MSCs的优势使其在再生领域具有广阔的应用前景，但如何将足够量的MSCs有效的递送到受损组织，这一过程仍存在相当多的挑战，限制了MSCs真正的临床应用，阻碍了MSCs移植治疗从实验室进入临床研究。

1 MSCs的治疗缺点

MSCs存在于体内低氧张力（即1%～5% O2）的微环境中，而一般培养环境（即20%～21% O2）的氧浓度，高于其原始生存环境[13-14]，因此，一旦将MSCs从原始组织中分离出来并诱导其在体外增殖，周围环境不足以维持其自我更新和分化的能力。随着周围微环境的改变，MSCs在分离和体外培养后将失去一部分功能。不仅如此，在各种疾病的病理状态下，MSCs自我更新和分化的能力降低，这限制了细胞资源的基本应用。体内移植后，特殊的病理环境显著降低了MSCs的自我更新能力和存活率。因此，尽管培养的MSCs被广泛应用于细胞移植，但低存活率和高凋亡率降低了其治疗效果。因此，如何增加细胞定向迁移的数量是干细胞移植的关键因素[15]。

针对这一问题，研究发现在其应用前对缺氧、药理学、化学制剂、营养因子、细胞因子和物理因子进行预处理能够激活生存信号，以对抗MSCs移植应用的微环境。最近研究表明，经过预处理的MSCs能显著提高细胞存活率，增加分化效果，促进旁分泌作用，提高损伤部位的修复能力[16-18]。预处理、基因修饰和MSCs培养条件的优化是提高MSCs在体内定值能力和体内发挥功能的关键，有助于提高组织工程和再生医学的MSC移植效果[16]。对MSCs进行预处理，基因修饰或使用生物材料包被后的移植为提高MSCs的存活率，促进其神经源性、血管生成性和免疫调节特性开辟了新的途径。Tang等[19]发现MSCs与褪黑素、Liu等[20]发现血管紧张素II、Li等[21]发现阿托伐他汀的预处理技术分别显示增强了脑缺血和心肌梗死的干细胞治疗。因此，研究更有效的途径来改善MSCs对ALF治疗效果是非常必要的。

2 MS C s的预处理

MSCs预处理的主要方法有：使用生物材料包被后移植、缺氧预处理、使用细胞因子预处理干细胞以提高其对恶劣环境的耐受性、改善干细胞移植区域的微环境和选用适当的基因对干细胞进行修饰等。

2.1 使用生物材料包被

2.1.1 胶原凝胶复合MSCs：采用胶原凝胶复合间充质干细胞治疗肝功能衰竭患者。胶原凝胶是水凝胶的一种，具有水凝胶的特性，可以形成立体三维网状支架，同时胶原蛋白作为天然的细胞外基质，它具有无毒、低免疫原性和可降解性的优点[4，11，15]。胶原是一种天然来源的高分子蛋白质，具有来源方便、体内可降解和低免疫原性等优势。胶原蛋白作为细胞外基质的主要成份，具有良好的生物相容性，被认为是理想的生物材料。它不仅为细胞的靶向递送提供载体，同时又为细胞粘附和组织三维重建提供支架作用，因此，可以提高移植细胞的运输效率，并且可以在体内提供移植细胞的生存空间，进而可以改善被移植细胞的存活率，并有助于在一定程度上解决单纯的干细胞移植所存在的滞留率和存活率低而限制了治疗效果的问题[22]。用生物材料承载干细胞可提升干细胞的治疗效应已得到广泛确认[23-24]。

2.1.2 细胞外基质（extracellular matrix，ECM）：ECM是由动物细胞合成并在细胞外分泌的大分子，其分布在细胞表面或细胞之间，主要是多糖和蛋白质，或蛋白多糖。这些物质构成复杂的网架结构，支持和连接组织结构、调节组织发育和细胞生理活动。ECM是微环境的重要组成部分，为维持细胞功能提供重要的生化与物理信号。该研究模拟了使用细胞外基质系统在体外培养间充质干细胞所需的三维微环境[25-26]，通过这种方式，获得具有临床级数量和“干性”维持能力的间充质干细胞。

2.1.3 GFc7：这是一种纳米螯合基纳米复合材料，它可以促进细胞增殖，表达多能性基因和自导标记和抗氧化防御；自发的分化相关基因被抑制，而决定细胞命运的特定的分化相关基因的方向显著上调[27]，进而能够提高MSCs的移植治疗效果。

2.2 缺氧预处理

O2对于细胞内稳态至关重要，因为缺氧是一些高发病率和高死亡率疾病的主要发病机制[28]。在缺氧条件下的预处理MSCs，如H2O2（氧化应激）和特殊细胞因子预处理是近年来提高MSCs生存率和潜能的常用策略[29]。对MSCs进行缺氧预处理包括先2.5% O2培养15 min，21% O2再氧化30 min，72 h的缺氧预处理可以显著提高MSCs在体外增殖和迁移的能力[30]，缺氧会降低MSCs的细胞活性和增殖，但复氧的这一过程会促进MSCs的恢复，进而提高其细胞活性。研究者证实缺氧和复氧还能够促进体外培养的MSCs的多效性[30-31]。缺氧预处理可以提高遗传稳定性和染色体稳定性，并确保MSCs在体外的安全性[32]。有证据表明，缺氧预处理MSCs的移植可以通过上调细胞因子和生长因子的分泌来增强治疗效果[33-34]。考虑到缺氧和复氧的优点，目前的研究主要集中在优化氧浓度，从而改善MSCs的细胞活性和治疗效果。虽然研究证实缺氧是MSCs在体外和体内的保护性因素，但仍有必要确定最佳氧浓度，以提高MSCs的存活率和治疗效果。

2.3 使用细胞因子对干细胞进行预处理

2.3.1 pHGF与MSCs联合治疗：促肝细胞生长素（promoting hepatocyte growth factor，pHGF）是从乳猪新鲜肝脏中提取纯化的一种小分子多肽类活性物质，一定浓度的pHGF可以提高细胞抗氧化的能力，从而达到抑制细胞凋亡和坏死的作用。其对稳定受损肝组织的环境，保护肝细胞，加速肝脏修复有一定的作用。pHGF对CCL4诱导的肝细胞损伤有良好的保护作用。该研究发现，pHGF与MSCs的组合可以更有效地下调ALF大鼠的全身炎症反应，从而减轻肝损伤，改善肝坏死，降低转氨酶水平[35]。总而言之，pHGF与MSCs在ALF大鼠模型治疗中的组合优于单独使用MSCs或pHGF，这可能与pHGF诱导的ALF大鼠模型肝脏中MSCs细胞数增加有关。

2.3.2 ZD和稳定的miR-210为基础进行预处理：miR-210的精确调控对于ALF的细胞稳态维持和移植效能的增强至关重要。在目前的研究中，我们证明了一种小分子zeaxanthin dipalmitate（ZD）可以增强人体脂肪源间充质干细胞（hAD-MSCs）在体外的抗应激能力，并提高其在体内移植后治疗ALF的效果[36]。ZD处理显著促进细胞存活并通过PKC/raf1/MAPK/NF-kappa B通路，抑制细胞凋亡、炎症和活性氧（ROS）的产生，维持了miR-210的高表达水平。基于ZD和稳定的miR-210的预处理，显著提高了干细胞移植的疗效，提高其抗氧化水平，并显著提高了移植治疗后肝脏组织的修复能力。维持miR-210的生理水平对hAD-MSC的体内平衡至关重要[36]。

2.4 改善干细胞移植区的微环境

基于干细胞治疗的临床应用的主要问题之一是由于损伤组织的氧化应激和炎症环境导致的低细胞存活率。迄今为止，包括NAC、edaravone和褪黑素在内的几种抗氧化剂，通过增强抵抗氧化应激、炎症、凋亡和其他应激源[37-39]的内源性防御能力，可以安全增强移植效果。

2.5 使用适当的基因修饰干细胞

MSCs不仅易于被基因载体所转染或感染，亦能稳定高效地表达特定的外源目的基因，因此MSCs是用于在基因治疗期间携带治疗基因的种子细胞的理想选择[40]，转基因技术可以提高MSCs在体内的功效，它可以通过分泌因子减少其在缺氧和炎症环境中的细胞凋亡，并增加其对受损组织的定植率和分化成特定组织的能力。

Zheng等[41]将白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra，具有抗炎和抗凋亡作用）转染到MSCs中，将高表达IL-1Ra的MSC移植入ALF大鼠后，与其他组相比，肝损伤、炎症因子（IL-1β、IL-6）和死亡率显著下降，并且MSCs在肝脏的定植率显著上升。Xiao等[42]使用壳聚糖纳米粒和IL-1Ra制备缓释结构，通过与MSCs共同移植到ALF猪中，肝细胞增殖水平和肝功能得到显著改善。Ma等[43]发现MSCs移植对ALF的定植率较低，而CXCR4转染的MSCs的定植率显著增加，促进了肝细胞的增殖和功能恢复。

2.6 化学修饰

由于转基因技术影响MSCs的特征，因此在细胞移植之前用药物预处理MSCs，它可以提高MSCs在炎症环境中的存活率和修复受损组织的能力。

2.6.1 自噬调节的MSCs：研究人员已经推出了一种新的策略，以增强基于MSCs的肝脏疾病，特别是ALF的细胞疗法。在短时间内，自噬调节的MSCs更有可能通过旁分泌的作用促进肝再生。进一步的研究，包括在MSCs扩展过程中对ATG7表达的评价，它对移植后的动物模型中MSCs的存活和追踪产生影响。MSCs的自噬抑制可以改善其肝再生潜能，并可作为改善ALF细胞治疗的新策略[44]。

2.6.2 氟西汀预处理的MSCs：氟西汀增强MSCs的存活和它们对MSCs的旁分泌特性。此外，氟西汀预处理的MSC组显示了神经营养因子（brain derive neurotrophic factor，BDNF）和血管生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA的表达显著升高改善了MSCs旁分泌的特性[45]。氟西汀对MSCs的预处理提高了它们的生存、旁分泌和免疫调节特性，并直接影响了神经组织形态学。

2.6.3 中草药对MSCs的保护：研究发现某些中药可以用于保护MSCs，使其免受伤害，并增加MSCs在体外的分化含量。黄芪甲苷可以抵抗氧化性链球菌的损伤，通过降低NF-kB p65的易位，以及增加MMP-2表达[46]，能够促进MSCs增殖，并抑制MSCs中Toll样受体4 （Toll-like receptor 4，TLR4）的高糖诱导表达。

2.7 骨髓联合移植

1978年Schofield[47]首先提出了龛（niche）的概念，造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）固定于微环境中。随着研究的深入发现，骨髓微环境是一个三维结构环境，是体内容纳干细胞生存并调控其自我更新、分化发育、归巢定位的细胞微环境，它主要包括基质细胞、细胞外基质和各种细胞因子。HSCs和MSCs是存在于其中的两类干细胞。Urban等[48]在1型糖尿病的动物模型中将MSCs和骨髓细胞（bone marrow cells，BMCs）共同移植到糖尿病小鼠体内时发现血糖及胰岛素水平可以恢复到正常水平，但是单一移植则没能够达到相同的效果。MSCs和BMCs协同诱导受体来源的胰腺胰岛素分泌细胞再生。其次，MSCs可以抑制T细胞介导的针对新生细胞的免疫反应。Moioli等[49]也发现在骨损伤后的血管形成过程中，联合移植MSCs和HSCs，血管数量和直径较单独移植MSCs时显著增加，联合移植促进组织血管化和再生。在骨组织、肌肉组织及真皮组织等依赖血管形成的损伤修复及内脏组织再生中，HSCs有协同MSCs的作用。MSCs与其周围的微环境一起移植到肝脏，在肝脏的新的微环境中，骨髓间充质干细胞可能会发挥更好的修复损伤肝组织的作用，为临床治疗ALF提供新的思路和方法。

3 结语

MSCs已被证明可以保护组织和器官免受外部伤害，然而研究发现，MSCs一旦离开原始组织并在体外诱导增殖，周围微环境的变化就不足以维持其分化和自我更新。随着微环境的改变，会导致体外培养的MSCs丧失部分生物学功能。此外，在移植过程中，只有少数细胞能够迁移到受损的组织中，移植后的低细胞存活率显著降低了其治疗效果。因此，尽管近年来MSCs细胞移植得到迅速发展，但是仍然有相当多的挑战限制了MSCs真正的临床应用，仍有必要研究更有效的途径来改善其治疗效果。MSC修饰或MSCs与其他治疗方法的结合也越来越受到重视，培养条件的预处理、遗传修饰和优化是提高MSCs体外和体内功能的关键策略，所有这些步骤都有助于提高MSCs移植在组织工程和再生医学中的效能，但是还应该对MSCs修饰的具体机制进行更多的研究，进一步阐明相关修饰是如何影响移植到体内的MSCs的生物学活性，进而使得MSCs的治疗可以得到更广泛的应用，并从实验室研究中推动MSCs移植进入临床研究阶段。