细胞外囊泡在肝细胞癌及胆管癌诊治中的作用研究进展

解飞虎，冯时，孙乐家，毛一雷

（中国医学科学院北京协和医院 肝脏外科，北京 100730）

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是细胞旁分泌产生的亚细胞成分，由脂质双分子层包裹形成球形囊泡，内含丰富的核酸、脂质、蛋白等，参与细胞间的物质交换和信息交流。依据其产生来源和生物学特点又分为外泌体、微囊泡和凋亡小体，其中关于外泌体的研究较为广泛，微囊泡次之[1]。EVs最初被认为是细胞排泄代谢产物的一种细胞结构，随着研究的深入，人们发现EVs参与机体内众多的生理、病理活动。近年来研究发现EVs是肿瘤细胞与靶细胞信息交流的重要方式，能通过调节肿瘤细胞的微环境，调控肿瘤细胞的增殖、转移和浸润能力[2-3]。EVs携带来源肿瘤细胞内特定的核酸、蛋白等分子物质，具有很强的肿瘤特异性，有望成为新型分子标志物用于良恶性疾病诊断和预后判断等，其球形载体的特殊结构，同时也是良好的新药研发工具[2-5]。肝细胞肝癌（hepatocellular cancer，HCC）是最常见的原发性肝肿瘤，因缺乏早期典型的临床表现，很多肝癌患者在确诊时已丧失根治性切除机会。对于晚期肝癌患者，介入栓塞、靶向治疗以及化疗等只能有限延长患者的生存期[6-7]。胆管癌（cholangiocarcinoma）约占消化道肿瘤的3%，同样由于缺乏早期的临床表现，胆管癌的早期诊断和根治性手术切除率亦较低[7-8]。新近研究发现EVs在肝细胞癌和胆管癌的发生发展中扮演十分关键的角色，在肿瘤的诊断和相关治疗中具有巨大的临床应用前景[1-3]。本文就EVs在肝细胞癌和胆管癌的诊断及治疗中的研究进展做一综述。

1 肝脏来源的EVs及其生理特点

肝脏是多细胞实质性脏器，由肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞、窦内皮细胞，和Kupffer细胞等免疫细胞组成[9]。肝脏发挥正常生理功能有赖于肝内细胞之间的物质交换和信息交流。除了自分泌、旁分泌和细胞间直接接触等信息交流方式外，肝细胞来源的EVs是肝内信号转导的重要载体。在体外实验中，大多数上述肝内的细胞都可以分泌EVs。不同细胞分泌的EVs有着不同的功能，如来自肝细胞的EVs能调节自身的增殖，来自肝星状细胞的EVs参与肝纤维化的形成[10]。在细胞受刺激或在疾病状态下，肝细胞分泌的外泌体及微囊泡会发生明显量和质的改变，囊泡内蛋白及核酸的构成也会发生改变[11]。

胆汁由肝细胞合成后流经胆道进行排泄，收集肝细胞、胆管细胞及各种免疫细胞分泌的EVs。胆汁中EVs中含有丰富的miRNA、Inc-RNA和蛋白等，参与胆道内正常微环境的调节[12]。Masyuk等[13]在研究胆汁中EVs生理特点时发现，胆汁EVs可粘附于胆管上皮细胞纤毛，通过降低磷酸化的ERK1/2的比例和促进miR-15a的表达，抑制胆管细胞的增殖。Wang等[14]发现鸡胆汁EVs可促进CD4+和CD8+T细胞的增殖和肝内巨噬细胞的活化，参与免疫应答。Severino等[15]发现胆管癌及胰腺癌患者胆汁EVs浓度明显升高，依据胆汁中EVs浓度鉴别良恶性胆道疾病及胰腺疾病具有非常好的灵敏度和特异性。

在肝硬化的发生过程中，肝星状细胞是分泌大量不溶性胶原促进纤维化形成的主要效应细胞，肝星状细胞的活化是肝硬化发生的核心环节。Chen等[16]发现在肝星状细胞活化过程中，肝星状细胞分泌的EVs中扭曲基因相关蛋白1（TWIST1）的含量明显下降，降低了miR-214的表达，间接促进结缔组织生长因子2（connective tissue growth factor 2，CCN2）的合成，而后者是CCN2依赖性纤维化过程的核心物质。Charrier等[17]发现活化后的肝星状细胞可以将CCN2打包到EVs中，EVs将CCN2转运至其他静止期或活化后的肝星状细胞，进一步促进肝纤维化发生。

2 EVs在肝细胞癌和胆管癌中的诊断价值

与非肿瘤细胞相比，肿瘤细胞分泌EVs的浓度及其内容物成分迥异。有学者在对卵巢癌和肺癌细胞EVs中的RNA成分进行研究时发现，其与非肿瘤细胞EVs中的miRNA种类明显不同，可以作为卵巢癌及肺癌的诊断性的生物标志物[18-19]。另有研究发现，胰腺癌患者血清EVs浓度明显升高，利用血清中多糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（glypican-1，GPC-1）表达阳性的EVs可以准确的区分胰腺癌和良性胰腺病变，并且GPC-1阳性的EVs浓度和胰腺癌患者生存期相关[20]。

2.1 EVs在肝细胞癌中的诊断价值

肝细胞癌患者多无明显的临床表现，挖掘潜在的生物标志物一直是肝癌诊疗领域的一个重要议题。Valadi等[21]在2007年首次研究发现外泌体可携带mRNA和miRNA至其他细胞，并在靶细胞内表达出相应蛋白产物。而后大量的证据表明肿瘤细胞EVs包含多种类型的RNA，具有很好的肿瘤特异性，可以作为潜在的生物标志物[22-25]。

成熟EVs miRNA约占总EVs RNA的40%以上[3]。体外实验中肝癌细胞来源的EVs包含多种miRNA，如miR-584，miR-517c，miR-378等[21]，动物实验中肝癌细胞EVs miRNA包括miR-10b、miR-21和miR-718等[22]。Sohn等[23]研究发现与乙肝及肝硬化患者相比，肝癌患者血清多种EVs miRNA明显升高，包括miR-18a，miR-221，miR-222和miR-224等，而miR-101，miR-106b，miR-122和miR-195则低于前两者。Sugimachi等[24]研究发现，与肝移植术后无复发的肝癌患者相比，术后复发患者的血清EVs miR-718的表达明显下降，mi-R718的下降水平与肝癌细胞的侵袭性相关。Wang等[25]研究发现肝癌患者的血清EVs miR-21的表达水平较健康人群及慢性乙型肝炎患者明显升高，且miR-21的高表达和患者的肝硬化程度和肿瘤分期相关。

2.2 EVs在胆管癌中的诊断价值

Severino等[15]研究发现胆管癌和胰腺癌患者胆汁EVs浓度明显升高，是胆管结石和慢性胰腺炎的患者胆汁EVs浓度的10倍左右，依据胆汁EVs浓度进行胆管癌与胆管结石、胰腺癌和慢性胰腺炎的诊断实验，诊断准确性可达到100%。该研究结果提示依据胆汁EVs浓度进行良恶性胆道梗阻的诊断效能明显优于血清CA19-9。Arbelaiz等[26]研究发现胆管癌、原发性硬化性胆管炎及肝细胞癌患者血清EVs浓度无明显差异，但EVs内包含的多种蛋白具有很高的诊断价值。与原发性硬化性胆管炎及肝细胞癌患者相比，胆管癌患者血清EVs C-反应蛋白、ficolin-2、纤维蛋白原γ链和血浆蛋白酶C1抑制剂等分泌水平更高，其中ficolin-2、血浆蛋白酶C1抑制剂等在早期胆管癌（I～II期）患者血清中明显升高，具有比血清CA19-9更高的诊断价值。Li等[27]研究发现人胆汁中含有了丰富的miRNA，与原发性硬化性胆管炎、慢性胰腺炎等良性疾病相比，胆管癌患者胆汁EVs中多种RNA（miR-191，miR-486-3p，miR-1274b）表达上调，用于诊断胆管癌具有良好的灵敏度和特异性。

3 EVs在肝细胞癌和胆管癌中的治疗价值

3.1 EVs在肝细胞癌中的治疗价值

EVs可作为携带miRNA的载体，在肝细胞癌的基因靶向治疗中有重要的潜在应用价值。Wei等[28]研究发现，Vps4A可通过抑制PI3K/Akt通路，促进肝癌细胞内抑癌性miRNA的累积，抑制肝细胞癌的发展。而在肝癌细胞内及其EVs中，Vps4A的表达水平很低，通过提高EVs Vps4A的表达有可能达到抗肿瘤的治疗目的。Lou等[29]研究发现，用miR-122转染脂肪间充质干细胞分泌的EVs，将转染后的Evs添加到肝癌细胞培养基中，可以诱导肝癌细胞周期G0/G1停滞和细胞凋亡。在肿瘤内部注射转染后的EVs，可以增强索拉菲尼的抗肝癌疗效。

在一项小鼠肝癌模型的实验中，研究者将体外培养的H22肝癌细胞置于甲氨蝶呤等化疗药物和紫外线照射下，细胞相继发生死亡后获得携带化疗药物的微囊泡。然后在培养基中分别直接应用游离的甲氨蝶呤和微囊泡携带的相同剂量的甲氨蝶呤分别造成了2%和23%的细胞死亡。摄取了“毒性”微囊泡后的肿瘤细胞会进一步分泌具有细胞毒性的囊泡，产生一种多米诺效应式的细胞杀伤作用。微囊泡携带的甲氨蝶呤在抑制肿瘤生长和延长小鼠生存时间上较游离甲氨蝶呤更为有效[30]。

3.2 EVs在胆管癌中的治疗价值

Li等[31]研究发现胆管癌细胞内和细胞微环境中miR-195表达均下调，用miR-195转染成纤维母细胞来源的EVs，转染后的EVs被胆管癌细胞摄取后在肿瘤内富集，可以缩小肿瘤体积，并延长小鼠肿瘤模型的生存时间。

4 总结与展望

近十年来关于EVs的研究有了长足的进展，EVs能够直接反应来源组织细胞的代谢状态和生物学特性，能够携带来源组织细胞内特定核酸、蛋白等物质，肿瘤特异性极强，有望成为全新的生物分子标志物用于疾病的诊断和预后判断。EVs还可以通过调节免疫应答和携带核酸、蛋白质等物质至靶细胞、靶器官，起到杀伤肿瘤细胞的作用，可能成为新型的抗肿瘤治疗方式。现阶段尚有一些亟待解决的问题：EVs的合成、分泌、参与信息交流等过程的分子机制尚不明确；EVs的亚群的种类、特性需要更深入的研究；缺乏大量制备、分离、纯化及保存EVs的标准方案、方法等。关于EVs在肿瘤的发病及诊疗中潜在应用价值的研究尚处于起始阶段，相关研究有限，相信在不久的将来，EVs将在肿瘤早期诊断和治疗具有广阔前景。