云芝菌丝深层发酵培养基优化

周春元 朴向民 闫梅霞 崔丽丽 王英平

（中国农业科学院特产研究所，吉林长春130112）

云芝（Coriolus versicolor）隶属于多孔菌科、栓属的一种珍贵的药食同源真菌，又名杂色云芝、彩云革盖菌、千层蘑等，多为野生[1]。云芝含有丰富的多糖、蛋白质、多肽、氨基酸、紫色素、萜类等多种生物活性物质，具有清热、解毒、消炎、抗癌、保肝等功效[2]。现代药理学研究表明，云芝多糖是云芝中的主要生物活性成分[3]，其子实体和菌丝体中均含有多糖[4-5]。

季宏更等[6]、李宇伟等[7]、丁湖广[8]、周选围等[9]对云芝的高产栽培技术进行了研究。近年来，随着人们对云芝药用价值研究的深入，许多药品行业对其需求也越来越大，但由于人工栽培云芝生产周期长，产量低，导致供应不上生产的需求。为此，研究云芝菌丝深层发酵技术非常重要。笔者以云芝菌丝生物量为研究指标，通过深层发酵进行研究，以期在短时间内生产大量菌丝体，为今后云芝多糖的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌种

云芝菌种来自中国农业科学院特产研究所菌种保藏室，菌株编号（TC001）。

1.1.2 仪器

HZQ-F160振荡培养箱，哈尔滨市东联生化仪器有限公司，PL4002精密电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司，BMJ霉菌培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂，SW-CJ-IFD洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂，GZX-9146 MBE电热鼓风干燥箱。

1.2 试验方法

1.2.1 基础培养基

葡萄糖2%，酵母粉1%，MgSO40.1%，KH2PO40.2%，自然pH，121℃灭菌30 min[10]。

1.2.2 培养方法

按基础培养基配方，分别选用不同的碳源（蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麦芽糖）、氮源（牛肉膏、蛋白胨、尿素、硝酸铵），进行碳、氮源比较试验；以菌丝干重作为选择标准，筛选出适合云芝深层发酵培养最佳培养基。以上试验均采用250 mL的三角瓶装内装入100 mL培养基置于恒温振荡培养箱（转速150 r/min）中培养7 d。重复3次。

1.2.3 生物量的测定

用4层纱布过滤发酵液，菌丝体经蒸馏水冲洗3次后，在50℃的条件下烘干至恒重，电子天平称菌丝体干重[11]。

2 结果与分析

2.1 碳源种类筛选

在基础培养基中分别加入5种不同碳源，取代基础培养基中的葡萄糖进行碳源试验。从图1可以看出，云芝菌丝深层发酵以蔗糖作为碳源效果最好，其次是葡萄糖和可溶性淀粉，而乳糖对菌丝生长的影响最小。

2.2 氮源种类筛选

在基础培养基中分别加入5种不同氮源，取代基础培养基中的酵母粉进行氮源试验。从图2可以看出，云芝菌丝深层发酵以牛肉膏作为氮源效果最好，其次是蛋白胨，而尿素对菌丝生长的影响最小。

图1 不同碳源对菌丝生长的影响

2.3 正交试验因素水平

在上述单因素试验基础上，以蔗糖为碳源，牛肉膏为氮源，MgSO4和KH2PO4为无机盐，设计四因素三水平正交试验L9（34），各因素水平及正交试验结果见表1、表2。

表1 正交试验因素水平

2.4 正交试验条件

以蔗糖为碳源，牛肉膏为氮源，进行L9（34）正交试验。上述试验结果表明，蔗糖的级差最大，其次是牛肉膏的级差最小，各因素对菌丝产量影响的主次顺序为：蔗糖＞牛肉膏＞KH2PO4＞MgSO4。

表2 L9（34）正交试验结果与极差分析

为了进一步明确各因素对菌丝产量的影响，进行了方差分析（表3）。从方差分析看，蔗糖、牛肉膏、KH2PO4和MgSO4在99%的置信度下对指标的影响均极显著，MgSO4在95%的置信度下对指标的影响显著，此结果与级差的直观分析一致。因此，四种因素最佳组合为：蔗糖2%，牛肉膏0.3%，KH2PO40.3%，MgSO40.05%。

图2 不同氮源对菌丝生长的影响

表3 正交试验的方差分析

3 小结与讨论

以云芝菌丝生物量为研究指标，通过单因子试验结果表明，云芝菌丝深层发酵适宜的碳源为葡萄糖，适宜的氮源为牛肉膏。在碳源、氮源筛选的基础上，通过正交试验得出最佳的培养基配方为：蔗糖2%，牛肉膏0.3%，KH2PO40.3%，MgSO40.05%。

关于云芝菌丝液体培养基优化，况明燕等[12]研究表明：云芝菌丝液体发酵适宜条件为2%乳糖，0.3%酵母浸膏，pH4.5，培养时间6 d，菌丝量最高为3.950 g/L；曾化伟等[13]研究表明：最优培养基配方为黄豆饼粉20 g/L，葡萄糖30 g/L，玉米粉10 g/L，酵母膏5 g/L，CaCO31.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO41.5 g/L，pH自然，菌体干质量为21.00 g/L；于清伟等[14]研究结果表明：最适pH为6，最适温度为25～30℃，最适装液量为150 mL。本研究结果与前人研究有所不同，可能与云芝菌株不同产地有关。