丽水锥栗林下大型真菌生态调查及分子鉴定

薛振文 高凤娟 应国华 吕明亮 李伶俐

（1丽水市林业科学研究院，浙江丽水323000；2丽水学院，浙江丽水323000）

锥栗[Castanea henryi（Skam）Rehd.et Wils.]壳斗科（Fagaceae）栗属，是浙西南尤其是浙江庆元县的主要的经济树种，栽培面积达4000 hm2。锥栗是菌根共生树种之一，在天然锥栗林中有菌根菌与之共生，形成互惠互利关系。目前生产中锥栗育苗主要采用实生苗培育后嫁接良种的繁殖方法，苗木质量参差不齐，优质苗木比例低，造林成活率低，几乎没有采用菌根技术接种菌根菌进行菌根苗的培育方式。研究拟通过锥栗林下外生菌根真菌种类的调查及与锥栗共生关系的研究，筛选出能与锥栗共生的菌根真菌种类，确定优势菌根菌，为锥栗菌根苗的生产应用和开发利用菌根菌奠定基础。

1 生态调查

1.1 生态条件

试验调查地浙江丽水市庆元县岭头乡包裹村（海拔 1111 m，地理坐标为 27°32′23.25″N，119°14′21.34″E）和屏都街道余村（海拔409 m，地理坐标为 27°35′48.2″N，118°59′10.9″E）锥栗人工纯林。锥栗品种为油榛、黄榛、乌壳长芒等优良家系，树龄14～18年，盛产期；锥栗距地面10 cm处的直径15.6 cm±3.4 cm，树高6.2 m±1.4 m，郁闭度0.7～0.8。林地土壤为红壤。当地属亚热带季风气候，年平均气温17.6℃，最热月（7月）平均气温26.9℃，最冷月（1月）平均气温7℃，年平均降水量1746.9 mm，年均相对湿度77%，年平均无霜期255 d。

1.2 生态调查方法

沿路踏查选择三块大型真菌子实体较多的样地，对每块样地采用普查方式进行研究。采用罗盘仪测量法测定样地面积，采集样地内大型真菌、分类编号A-F、统计数量、记录和拍照。为证实子实体与锥栗是否共生关系，采集时沿子实体基部小心挖开表面土壤，在土壤的菌丝层中，仔细寻找菌丝或菌索来确认与锥栗根系相连，挖取20 cm×20 cm×20 cm带土根系带回实验室内挑取菌根观察形态。

2 分子鉴定材料与方法

2.1 分子鉴定材料

待分子鉴定的子实体编号为A、B、C、D。

2.2 分子鉴定方法

2.2.1 DNA的提取

采用改良的CTAB法[1]提取DNA，得到的DNA作为PCR扩增的模板。

2.2.2 PCR扩增

采用真菌rRNA基因的ITS区扩增通用引物ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）; 和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’）进 行PCR 扩增[2]。PCR 扩增体系包括（25 μL）：DNA 模板2 μL，引物ITSIF和ITS4各0.5 μL，10×PCR 缓冲液 2.5 μL，dNTPs 2 μL，rTaq 聚 合 酶 0.125 μL，ddH2O 25 μL。反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s；54℃退火30 s；72℃延伸45 s，32个循环；72℃终延伸5 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳分离，并于凝胶成像系统下观察并照相。

2.2.3 rDNA ITS序列测定与分析

上述PCR反应产物送金斯瑞测序公司进行测序。对测得的供试菌株rDNA ITS区段DNA序列运用GenBank中的BLAST工具软件在DNA序列数据库中搜索同源DNA序列并进行比较分析，根据BLAST搜索和比较的结果，判断真菌的物种或与其近缘的物种。

3 结果与分析

3.1 生态调查

对分布于海拔400～1100 m的锥栗林调查发现有6种大型真菌。经菌索追踪发现橙黄硬皮马勃、芝麻厚瓤牛肝菌、双型褶孔牛肝菌均与锥栗根系相连，可初步确定为菌根菌。橙黄硬皮马勃是锥栗林最常发生的外生菌根菌，于6-10月发生，海拔越高马勃发生越迟。充足降雨之后，连续3～5 d的高温天气子实体会大量发生。

图1 标本A橙黄硬皮马勃Scleroderma citrinum

图2 标本B芝麻厚瓤牛肝菌Hourangia nigropunctata

图3 标本C双型褶孔牛肝菌Phylloporus dimorphus

图4 标本D蜡蘑未知种

图5 标本E 黑柄炭角菌Xylaria nigripes（Kl.）Sacc.

图6 标本F鸡Termitornyces sp.

为了研究菌根菌的优势种类，统计了三块样地三种菌根菌的子实体发生量（表1），橙黄硬皮马勃发生量最多，密度达0.0875个/㎡，可以确定橙黄硬皮马勃为调查样地的优势菌根菌；调查发现在低海拔的锥栗林下比高海拔条件下橙黄硬皮马勃发生密度更大，发生时间更早。芝麻厚瓤牛肝菌和双型褶孔牛肝菌仅仅发生在高海拔1111 m锥栗林下，芝麻厚瓤牛肝菌和双型褶孔牛肝菌发生平均密度分别为0.0343个/㎡、0.0272个/㎡，为高海拔锥栗林下较优势菌根菌。

表1 菌根菌发生量统计

调查发现位于屏都街道余村的锥栗林地套种黄精和竹荪后，当年橙黄硬皮马勃子实体发生量显著减少，且均发生于未耕作的边坡。第四年后橙黄硬皮马勃发生量明显增多，原因可能是松土耕作对锥栗菌根发育造成影响，从而影响橙黄硬皮马勃子实体发生。

3.2 子实体分子鉴定

表2 子实体分子鉴定结果

Hourangia nigropunctata和Phylloporus dimorphus中文名经咨询杨祝良老师获得，分别为芝麻厚瓤牛肝菌和双型褶孔牛肝菌。子实体形态描述参见文献[3，4]。

据报道[3]芝麻厚瓤牛肝菌在我国发现地域有云南的腾冲市，江城县、景洪县、湖南省宜章县，福建省三明市，海南省乐东县，贵州省道真县，海拔在1300～1900 m的松属、栲属、石栎属、栎属林地内。笔者在海拔1111 m的锥栗纯林下发现该牛肝菌，首次报道栗属的锥栗为芝麻厚瓤牛肝菌的共生树种。据报道[4]双型褶孔牛肝菌仅发现于泰国北部栲属林地内，笔者首次在栗属锥栗纯林下发现，国内未发现该牛肝菌的报道。

利用ITS序列分析结果表明：标本编号为D的子实体（图4）与酒色蜡蘑相似率仅为76%，可能为一种近似种或新种，经菌丝或菌索追踪未发现与锥栗根系相连，子实体周围有较厚的落叶层，推测非菌根菌。

4 结论与讨论

在庆元锥栗林地调查发现与锥栗共生的菌根菌种类有橙黄硬皮马勃、芝麻厚瓤牛肝菌和双型褶孔牛肝菌。低海拔条件下菌根菌发生时间早，高海拔条件下发生时间晚且种类较多。

在高、低海拔地区，橙黄硬皮马勃均为锥栗的优势菌根菌，建议采用接种有橙黄硬皮马勃的锥栗苗造林，既能促进锥栗生长，又能收获橙黄硬皮马脖子实体。

芝麻厚瓤牛肝菌或双型褶孔牛肝菌菌种分离、扩繁、菌根合成等技术有待继续研究，进而在高海拔地区营造菌根林，达到收获子实体和促进锥栗苗生长的目标。

由于土壤耕作破坏锥栗根系上菌根的生长发育，橙黄硬皮马勃发生明显减少，而边坡未耕作区仍然能发生子实体。

挖取的菌根经处理后解剖镜下挑取，观察菌根形态，由于野生菌根种类复杂，菌根发育期菌根形态差异较大等原因无法肉眼鉴定出菌根菌类型，需要借助分子手段，有待继续研究。