地佐辛对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及对Toll样受体4/核转录因子-κB信号通路的影响

李思海，杨 军，魏 娅

(河南中医药大学第三附属医院麻醉科，河南 郑州 450000)

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是一种常见的慢性综合征，临床表现为自发性疼痛、感觉异常或机械性疼痛等，若不进行适当干预则可能进展为中枢神经系统疾病或周围神经系统疾病[1]。NPP的发生涉及外周感受器、中枢感受器等多个级联环节及多种细胞受体、细胞因子、信号通路的参与[2]。炎症反应可由多种因素激活，在NPP发生中具有重要作用[3]。ALLISON等[4]研究发现，神经元的细胞炎性因子水平升高可能是导致神经性疼痛的原因，采用靶向炎症药物治疗可缓解神经性疼痛。炎性介质可通过一系列信号传递活化神经元内的蛋白激酶，调控细胞膜离子通道活性，使细胞内游离Ca2+浓度增加，进一步影响离子型N-甲基-D-门冬氨酸受体的功能，诱导脊髓背角区域敏感化，造成神经疼痛[5]。地佐辛是一种阿片受体激动-拮抗剂，静脉注射后可完全激活κ受体，对μ受体部分激活、部分抑制，实现镇痛作用，且很少产生呕吐、恶心等不良反应。临床应用表明，地佐辛可明显改善癌症患者和术后患者的疼痛感，且持续时间较长[6]，但地佐辛对NPP的作用尚不清楚。本研究通过观察地佐辛对NPP模型大鼠的镇痛作用及对Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)/核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)炎性信号通路的影响，探讨其减轻NPP大鼠疼痛的分子机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组无特定病原体级Sprauge Dawley大鼠90只，体质量200～220 g，购自上海邦耀生物有限公司，许可证号：SYXK(沪)-2014-0001。将大鼠随机分为假手术组、模型组、普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组，每组15只。各组大鼠均于(22.00±2.50) ℃、相对湿度50%～70%的干净、通风环境中单笼饲养，自由饮水、进食，自由活动。本研究涉及实验均经本院动物实验伦理委员会批准。

1.2主要试剂与仪器地佐辛(扬子江药业有限公司，国药准字H20080329，1 mL5 mg)，普瑞巴林胶囊(重庆赛维药业有限公司，国药准字H20130073)，氯化钠注射液(辅仁药业集团有限公司，国药准字H32023395)，青霉素钾注射液(河南新乡华星药厂，国药准字H41020816)，戊巴比妥钠(上海上药新亚药业有限公司，国药准字H31021724)，兔TLR4抗体、兔NF-κB抗体、兔甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体、酶标志羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)二抗(美国Abcam公司)，蛋白提取试剂盒、二氨基联苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic，BCA)试剂盒及白细胞介素-6(intedeukin-6，IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。1658001蛋白电泳仪、Trans-Blot SD半干转膜仪(美国Bio-Rad公司)，2500凝胶成像和分析系统(上海天能科技有限公司)，TGL-16B低温高速离心机(上海安亭科学仪器有限公司)，ND2000自动分光光度计(美国Thermo公司)，触觉测量套件(美国Stoelting公司)，390型热刺激器(上海玉研科学仪器有限公司)。

1.3动物模型制备模型组、普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠参照GRACE等[7]的方法制备NPP模型，术前禁食、不禁水12 h，给予戊巴比妥钠(45 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，俯卧位捆绑固定，脊椎背部皮肤消毒后，纵向切开第4～6腰椎部位背部中线皮肤，小心逐层分离脊椎左侧肌肉，暴露出第5腰神经，采用无菌3.0丝线结扎左侧第5腰神经，之后迅速逐层缝合背部切口，消毒后放回动物房。假手术组大鼠仅暴露第5腰神经，不予结扎，然后逐层缝合背部切口。术后各组大鼠均每日肌肉注射 4×104U青霉素，连续3 d。术后1 d，模型组、普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠均出现抬足次数增多、跛行、舔足等行为，提示NPP模型大鼠制备成功。若各实验组大鼠数量不足15只，则通过随机原则取备用大鼠补足。术后第4天，地佐辛低、中、高剂量组大鼠分别给予6、12、24 mg·kg-1地佐辛腹腔注射；普瑞巴林组大鼠给予18 mg·kg-1普瑞巴林腹腔注射；假手术组和模型组大鼠给予氯化钠注射液腹腔注射，各组注射量均为1 mL·kg-1，连续 7 d，每天1次。

1.4大鼠行为学测定

1.4.1机械痛阈值(mechanicalwithdrawalthreshold，MWT)检测术前及术后第4、11天测试前，大鼠于20 cm×25 cm×15 cm塑料盒中适应 30 min，采用Von-Frey细丝刺激大鼠左后足趾面，依次增强刺激力度，每次刺激持续4～6 s，以细丝现肉眼可见稍微弯曲为完全受力标准，当大鼠出现快速缩足时为阳性反应，记录此时刺激力度，即为MWT。每只大鼠测试5次，取平均值。

1.4.2热缩足反射潜伏期(thermalwithdrawallatency，TWL)检测术前及术后第4、11天测试前，大鼠于透明塑料盒中适应30 min，采用热刺激器产生的热束刺激大鼠左后足趾面，当大鼠出现特征性舔爪或提爪时为阳性反应，记录大鼠响应热刺激的潜伏时间，即为TWL。每只大鼠测试5次，取均值。为避免伤害实验动物，研究中测试时间为 30 s，触发温度为30 ℃。

1.5大鼠脊髓组织标本制备术后第11天处死各组大鼠，采集大鼠左侧脊髓，制备匀浆液，分为2份，1份于4 ℃下3 000 r·min-1离心5 min，取上清液置于-80 ℃保存，用于检测IL-6、MCP-1、TNF-α 水平；另1份置于-80 ℃保存，用于检测TLR4、NF-κB蛋白表达情况。

1.6各组大鼠脊髓组织中IL-6、MCP-1和TNF-α水平检测取-80 ℃保存的各组大鼠脊髓组织上清液，使用自动分光光度计采用ELISA试剂盒检测脊髓组织上清液中IL-6、MCP-1和TNF-α水平。

1.7各组大鼠脊髓组织中TLR4和NF-κB蛋白相对表达量检测取各组大鼠冷冻脊髓组织匀浆液适量，加入适量蛋白裂解液，部分用蛋白提取试剂盒提取脊髓组织总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白量，首先利用蛋白质标准液绘制标准曲线，然后用自动分光光度计测定待测蛋白吸光度值，根据标准曲线计算待测蛋白浓度。取30 mg蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜后以50 g·L-1脱脂奶粉封闭1 h；分别加入兔源TLR4、NF-κB、GAPDH(1500)抗体，4 ℃ 孵育过夜；洗净一抗后加入二抗(15 000)，室温孵育1 h。经Western blot化学发光液作用后拍摄图像，以TLR4、NF-κB蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值表示TLR4、NF-κB蛋白相对表达量。

2 结果

2.16组大鼠MWT比较结果见表1。各组大鼠术前MWT比较差异无统计学意义(F=0.261，P>0.05)。术后第4、11天，模型组、普巴瑞林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠MWT显著低于术前，差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组、普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠的MWT显著低于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.05)。术后第4天，模型组、普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠MWT比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后第11天，模型组大鼠MWT显著低于术后第4天，普巴瑞林组及地佐辛中、高剂量组大鼠MWT显著高于术后第4天，差异均有统计学意义(P<0.05)。术后第11天，普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠MWT显著高于模型组，普瑞巴林组及地佐辛中、高剂量组大鼠MWT显著高于地佐辛低剂量组，普瑞巴林组及地佐辛高剂量组大鼠MWT显著高于地佐辛中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)；地佐辛高剂量组与普瑞巴林组大鼠MWT比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表16组大鼠手术前、后MWT比较

组别n术前术后第4天术后第11天假手术组 1513.57±2.0613.79±2.49 13.62±2.45 模型组 1513.82±2.545.67±1.11ab3.75±0.71abc普瑞巴林组 1513.26±2.235.58±1.12ab11.86±1.97abcdef地佐辛低剂量组 1514.17±2.685.61±1.17ab5.94±1.12abd地佐辛中剂量组 1513.71±2.145.82±1.15ab8.74±1.69abcde地佐辛高剂量组 1513.93±2.435.73±1.14ab11.14±2.01abcdef

注：与术前比较aP<0.05；与假手术组比较bP<0.05；与术后第4天比较cP<0.05；与模型组比较dP<0.05；与地佐辛低剂量组比较eP<0.05；与地佐辛中剂量组比较fP<0.05。

2.26组大鼠TWL比较结果见表2。各组大鼠术前TWL比较差异无统计学意义(F=0.662，P>0.05)。术后第4天，模型组、普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠TWL比较差异均无统计学意义(P>0.05)。术后第4、11天，模型组、普巴瑞林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠TWL均显著低于术前，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组、普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠的TWL显著低于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；术后第11天，普巴瑞林组及地佐辛中、高剂量组大鼠TWL均显著高于术后第4天，差异有统计学意义(P<0.05)。术后第11天，普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠TWL显著高于模型组，普瑞巴林组及地佐辛中、高剂量组大鼠TWL显著高于地佐辛低剂量组，普瑞巴林组及地佐辛高剂量组大鼠TWL显著高于地佐辛中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)，地佐辛高剂量组与普瑞巴林组大鼠TWL比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表26组大鼠手术前、后TWL比较

组别n术前术后第4天 术后第11天假手术组 1512.25±2.1312.67±2.37 12.79±2.25 模型组 1512.34±2.345.89±1.15ab5.78±1.12ab普瑞巴林组 1511.67±2.095.91±1.16ab10.98±1.94abcdef地佐辛低剂量组 1513.12±2.346.78±1.34ab6.98±1.43abd地佐辛中剂量组 1512.68±2.496.23±1.23ab9.76±1.68abcde地佐辛高剂量组 1512.51±2.376.41±1.28ab11.03±2.05abcdef

注：与术前比较aP<0.05；与假手术组比较bP<0.05；与术后第4天比较cP<0.05；与模型组比较dP<0.05；与地佐辛低剂量组比较eP<0.05；与地佐辛中剂量组比较fP<0.05。

2.36组大鼠脊髓组织中IL-6、MCP-1及TNF-α水平比较结果见表3。术后第11天，模型组、普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠脊髓组织中IL-6、MCP-1和TNF-α水平显著高于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.05)；普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠脊髓组织中IL-6、MCP-1和TNF-α水平显著低于模型组，普瑞巴林组及地佐辛中、高剂量组大鼠脊髓组织中IL-6、MCP-1和TNF-α水平显著低于地佐辛低剂量组，普瑞巴林组及地佐辛高剂量组大鼠脊髓组织中IL-6、MCP-1和TNF-α水平显著低于地佐辛中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)；地佐辛高剂量组与普瑞巴林组大鼠脊髓组织中IL-6、MCP-1和TNF-α水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表36组大鼠脊髓组织中IL-6、MCP-1及TNF-α水平比较

组别nIL-6/(ng·L-1)MCP-1/(ng·L-1)TNF-α/(ng·L-1)假手术组 15153.31±22.21 12.46±3.32 241.23±25.94 模型组 15465.68±51.13a65.98±11.07a684.51±53.69a普瑞巴林组 15201.52±36.79abcd20.12±3.58abcd260.07±37.98abcd地佐辛低剂量组 15397.75±42.26ab52.27±9.43ab598.27±47.45ab地佐辛中剂量组 15252.51±35.46abc38.99±7.78abc421.43±52.83abc地佐辛高剂量组 15197.64±23.89abcd19.92±3.23abcd253.92±32.87abcd

注：与假手术组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05；与地佐辛低剂量组比较cP<0.05；与地佐辛中剂量组比较dP<0.05。

2.46组大鼠脊髓组织中TLR4、NF-κB蛋白相对表达量比较结果见表4、图1。术后第11天，模型组、普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠脊髓组织中TLR4蛋白、NF-κB蛋白相对表达量显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；普瑞巴林组及地佐辛低、中、高剂量组大鼠脊髓组织中TLR4蛋白、NF-κB蛋白相对表达量明显低于模型组，普瑞巴林组及地佐辛中、高剂量组大鼠脊髓组织中TLR4蛋白、NF-κB蛋白相对表达量明显低于地佐辛低剂量组，普瑞巴林组及地佐辛高剂量组大鼠脊髓组织中TLR4蛋白、NF-κB蛋白相对表达量明显低于地佐辛中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)；地佐辛高剂量组与普瑞巴林组大鼠脊髓组织中TLR4蛋白、NF-κB蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表46组大鼠脊髓组织中TLR4及NF-κB蛋白相对表达量比较

组别nTLR4蛋白NF-κB蛋白假手术组 150.51±0.110.47±0.14模型组 152.38±0.55a2.26±0.42a普瑞巴林组 150.55±0.09abcd0.48±0.08abcd地佐辛低剂量组 151.91±0.34ab1.89±0.23ab地佐辛中剂量组 151.15±0.12abc1.02±0.04abc地佐辛高剂量组 150.49±0.11abcd0.51±0.05abcd

注：与假手术组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05；与地佐辛低剂量组比较cP<0.05；与地佐辛中剂量组比较dP<0.05。

A：假手术组；B：模型组；C：普瑞巴林组；D：地佐辛低剂量组；E：地佐辛中剂量组；F：地佐辛高剂量组。

图16组大鼠脊髓组织中TLR4、NF-κB蛋白表达

Fig.1ExpressionofTLR4，NF-κBproteininspinalcordtissuesofratsinthesixgroups

3 讨论

NPP是由于躯体感觉神经系统损伤或疾病导致的功能障碍所引起的痛觉过敏、感觉异常等疼痛性感受[8-9]，及时有效地对早、中期患者进行干预和治疗，有利于控制神经系统损伤进程、改善神经系统功能[10]。机体脊髓及外周伤害性感受神经元的异常敏感化是NPP病变的首要步骤，伤害性感受神经元的去敏感化可抑制神经系统异常激活，减退中枢下行传递系统功能，产生镇痛效果[11]。目前，临床上采用的治疗药物多作用于单一靶点，治疗效果欠佳且不良反应多[12]。因此，寻找治疗效果好且不良反应少的药物是亟需解决的问题。

普瑞巴林是一种神经递质γ-氨基丁酸类似物，临床上已应用于治疗神经性疼痛[13]，具有起效快、吸收不受食物影响等优点，但可造成过度镇静、心脏毒性等不良反应。地佐辛是一种阿片类镇静剂，主要对κ受体具有特异激活作用，激活后的κ受体可产生脊髓水平的镇痛作用，具有镇痛效果好、依赖性低等优点[14]。因此，本研究以普瑞巴林作为标准参照药物，探究地佐辛对大鼠神经性疼痛的治疗作用，结果发现，地佐辛治疗后大鼠MWT显著升高，TWL显著延长，呈剂量依赖效应，且高剂量地佐辛作用效果与普瑞巴林一致，提示地佐辛对NPP大鼠具有镇痛作用，以高剂量效果最优，但其机制尚不清楚。WANG等[15]研究表明，地佐辛可通过抑制去甲肾上腺素的再摄取发挥抗疼痛作用，然而，其镇痛作用是否与脊髓炎症反应有关尚待进一步研究。

李秋月等[16]研究指出，TNF-α等促炎性因子与NPP密切相关。Toll样受体可参与识别多种病原物，表达于白细胞、树突状细胞等表面[17]。一些Toll样受体如TLR4与炎症信号通路的激活密切相关，参与多种疾病的发生、发展[18]。有研究表明，NPP患者的神经细胞炎症反应被激活后可导致一系列病变，进而引起NPP[19]。因此，炎症反应在NPP中的作用被逐渐重视。本研究结果显示，模型组大鼠脊髓组织中IL-6、MCP-1及TNF-α水平显著高于假手术大鼠，提示NPP模型大鼠脊髓组织存在一定炎症反应。GOURD等[20]研究表明，普瑞巴林可减轻放射治疗相关的NPP。本研究发现，低、中、高剂量地佐辛治疗后，大鼠脊髓组织中IL-6、MCP-1及TNF-α水平均显著降低，且高剂量地佐辛干预效果与普瑞巴林一致，提示地佐辛可减轻NPP大鼠脊髓组织炎症反应，其中以高剂量效果最优。细胞表面TLR4表达增加后，可激活TNF-α等下游炎性因子表达，通过一系列级联反应促进NF-κB蛋白表达，进一步激活MCP-1、IL-6等促炎性因子表达[21]。本研究发现，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织中TLR4、NF-κB蛋白相对表达量显著升高，提示NPP大鼠脊髓组织中TLR4/NF-κB炎性信号通路处于激活状态。经低、中、高剂量地佐辛治疗后，大鼠脊髓组织中TLR4、NF-κB蛋白相对表达量均显著低于模型组，且高剂量地佐辛干预后最低，推测地佐辛可能通过抑制TLR4/NF-κB炎性信号通路，减轻大鼠NPP。

综上所述，地佐辛可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活而减轻脊髓炎症反应，从而提高NPP大鼠MWT，延长TWL，发挥镇痛作用。然而，本研究仅涉及地佐辛对TLR4/NF-κB信号通路及相关炎性因子在大鼠脊髓组织中表达的影响，有待对该通路进行深入研究。