透骨祛痹方抗炎镇痛作用与急性毒性试验研究

周雅琪，蒋 林，郭勇秀，随家宁，魏博伟，李芳婵

（广西中医药大学，广西 南宁 530200）

透骨祛痹方是治疗膝关节滑膜炎的壮药验方，由三加皮、滇白珠、常春卫矛、石南藤、青风藤等十味药组成，具有祛风清热、利水除湿、消肿止痛、强筋健骨的功效，治疗膝关节滑膜炎疗效显著且安全可靠。本课题组前期已对透骨祛痹方进行了提取工艺考察，确定了最佳提取工艺。为进一步探索透骨祛痹方的作用机理为临床使用提供药理实验依据，本实验研究透骨祛痹方乙醇提取物的抗炎镇痛作用及其急性毒性。

1 实验材料

1.1 动物 KM小鼠，雌雄兼用，体质量18～22 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号:SCXK（湘）2016-0002。动物购入后，饲养于空调实验室内，喂颗粒标准饲料，自由饮水和摄食，保持清洁。

1.2 药物与试剂 三加皮采自广西壮族自治区防城港，滇白珠、常春卫矛、五指毛桃、石南藤、青风藤、海桐皮、防己、薏苡仁、三白草根均购自玉林药材市场，所有药材经广西中医药大学朱意麟老师鉴定，均符合药典要求。阿司匹林肠溶片（沈阳奥吉娜药业有限公司，批号:H20065051）；角叉菜胶（北京索莱宝科技有限公司，批号:524C051）；琼脂（北京索莱宝科技有限公司，批号:731U022）；甲醇（成都市科隆化学品有限公司，批号:2018072001）；乙醇（成都市科隆化学品有限公司，批号:10009218）；生理盐水［回音必集团（江西）东亚制药有限公司，批号:2018072914］；冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司，批号:20160606）；小鼠前列腺素 E2（PGE2）试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司，批号:201605）。

1.3 实验仪器 智能热板镇痛仪（成都泰盟软件有限公司）；98-I-B型电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；RE-6000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SQP型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；752型紫外-可见分光光度计（UV-1780，日本岛津仪器有限公司）；水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 透骨祛痹方乙醇提取物的制备 按照透骨祛痹方处方比例称取药材，加入50%乙醇回流提取2次，每次90 min，过滤，合并滤液后回收乙醇，浓缩，制得浸膏备用，每克浸膏含11.43 g生药。

2.2 抗炎试验

2.2.1 角叉菜胶致小鼠足肿胀试验［1-2］取KM小鼠40只，随机分为5组，分别为模型组、阿司匹林组（予阿司匹林50 mg/kg）及透骨祛痹方醇提取物高、中、低剂量组（0.66 mg/kg、0.33 mg/kg、0.17 mg/kg），每组8只。用药组每天灌胃给药1次，模型组给予等体积生理盐水，连续7 d，末次灌胃30 min后，所有小鼠右后足皮下注射1%角叉菜胶0.03 ml致炎，4 h后脱颈椎处死各小鼠，于膝关节处剪下炎足，称重，将其充分剪碎，于2 ml生理盐水中浸泡1 h，3 000 r/min离心20 min，仔细收集上清液0.25 ml，加入0.5 mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液2 ml，于50℃恒温水浴锅水浴20 min后加入5 ml甲醇稀释，以酶联免疫吸附法测定PGE2的含量，严格按照试剂盒说明书进行。

2.2.2 琼脂肉芽致小鼠炎症试验［3］取KM小鼠40只，随机分为5组，分别为模型组、阿司匹林组（50 mg/kg）及透骨祛痹方醇提取物高、中、低剂量组（0.66 mg/kg、0.33 mg/kg、0.17 mg/kg），每组8只。所有小鼠均在背部皮下注射2%琼脂，每只0.3 ml，用药组于第二天开始连续用药7 d，模型组给予等体积生理盐水，第8天将小鼠脱颈椎处死，剥离琼脂肉芽块，并称湿重，并计算肿胀抑制率，抑制率=（模型组琼脂肉芽重量－给药组琼脂肉芽重量）/模型组琼脂肉芽重量×100%。

2.2.3 对小鼠扭体反应的影响［4］取KM小鼠40只，随机分为5组，分别为模型组、阿司匹林组（50 mg/kg）及透骨祛痹方醇提取物高、中、低剂量组（0.66 mg/kg、0.33 mg/kg、0.17 mg/kg），每组8只。给药组每天灌胃给药1次，模型组给予等体积生理盐水，连续7 d。末次灌胃1 h后，每只小鼠按10 ml/kg腹腔注射0.8%醋酸溶液，立即观察并记录15 min内各组小鼠的扭体次数，以扭体次数作为痛反应指标，并计算药物对扭体反应的抑制率。

2.2.4 对热板致痛反应的影响［5］取KM雄性小鼠50只，实验前将小鼠置于智能热板仪55.0±0.5℃进行筛选，以小鼠舔后足反应的潜伏期为痛阈指标，选取反应潜伏期在8～30 s的合格雄性小鼠40只，随机分为5组，每组8只，分别为空白组、阿司匹林组（50 mg/kg）及透骨祛痹方醇提取物高、中、低剂量组（0.66 mg/kg、0.33 mg/kg、0.17 mg/kg）。空白组给予等体积生理盐水，给药组连续灌胃给药7 d，每天1次。分别测定给药前及末次给药后30 min、60 min、90 min各鼠的痛阈值。将每只小鼠正常痛阈值各测2次，每次间隔5 min，取其平均值为给药前正常痛阈值，比较同组给药后不同时间平均痛阈与基础痛阈的差异，判断是否有镇痛作用。

2.3 急性毒性试验 按LD50方法［5］测定。由预实验可知透骨祛痹方醇提取物致100%动物死亡剂量（5.035 mg/kg）和0%动物死亡剂量（1.1925 mg/kg）。取KM小鼠60只，雌雄各半，随机分为3组（5.0350mg/kg、2.5175 mg/kg、1.1925 mg/kg共3个剂量组）。小鼠禁食不禁水12 h后，按40 ml/kg灌胃给予透骨祛痹方醇提取物，1次/天。给药后连续观察14 d，并记录小鼠毒性反应、死亡数和死亡情况，用Bliss法计算LD50及95%置信区间。

2.4 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 透骨祛痹方乙醇提取物对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响 见表1。

表1 透骨祛痹方乙醇提取物对小鼠炎症组织中PGE2含量的影响

表1 透骨祛痹方乙醇提取物对小鼠炎症组织中PGE2含量的影响

注:与模型组比较，①P＜0.05

n 8 8 8 8 8剂量（mg/kg）－50 0.66 0.33 0.17 PGE2含量（μmol/L）1.20±0.11 0.98±0.12①0.94±0.31①0.96±0.19①0.99±0.14①组 别模型组阿司匹林组透骨祛痹方醇提取物高剂量组透骨祛痹方醇提取物中剂量组透骨祛痹方醇提取物低剂量组

由表1可知，与模型组比较，透骨祛痹方乙醇提取物高、中、低剂量组和阿司匹林组均可不同程度降低角叉菜胶致炎小鼠组织中PGE2含量（P＜0.05）。

3.2 透骨祛痹方乙醇提取物对小鼠琼脂肉芽肿的影响 见表2。

表2 透骨祛痹方乙醇提取物对小鼠琼脂肉芽肿的影响

表2 透骨祛痹方乙醇提取物对小鼠琼脂肉芽肿的影响

注:与模型组比较，①P＜0.01；与阿司匹林组比较，②P＜0.01

n 8 8 8 8 8剂量（mg/kg）－50 0.66 0.33 0.17肉芽肿重量（mg）0.17±0.018 0.13±0.019①0.08±0.037①②0.13±0.018①0.16±0.023抑制率（%）－21.32 52.94 22.06 4.41组 别模型组阿司匹林组透骨祛痹方醇提取物高剂量组透骨祛痹方醇提取物中剂量组透骨祛痹方醇提取物低剂量组

由表2可知，与模型组比较，透骨祛痹方乙醇提取物高、中剂量组和阿司匹林组对小鼠琼脂肉芽肿炎症均有显著抑制作用（P＜0.01），且高剂量组作用优于阿司匹林组（P＜0.01）。

3.3 透骨祛痹方乙醇提取物对醋酸致小鼠扭体的影响 见表3。

表3 透骨祛痹方乙醇提取物对醋酸致小鼠扭体反应的影响

表3 透骨祛痹方乙醇提取物对醋酸致小鼠扭体反应的影响

注:与模型组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；与阿司匹林组比较，③P＜0.05

n 8 8 8 8 8剂量（mg/kg）－50 0.66 0.33 0.17扭体次数28.91±9.49 19.02±6.26①11.40±3.74②③17.14±6.06②③23.07±9.56扭体抑制率（%）—34.21 60.61 40.70 20.36组 别模型组阿司匹林组透骨祛痹方醇提取物高剂量组透骨祛痹方醇提取物中剂量组透骨祛痹方醇提取物低剂量组

由表3可知，与模型组比较，透骨祛痹方乙醇提取物高、中剂量组和阿司匹林组均能明显减少醋酸所致小鼠扭体次数（P＜0.05或P＜0.01）。与阿司匹林组比较，透骨祛痹方醇高、中剂量组的作用更明显（P＜0.05）。

3.4 透骨祛痹方乙醇提取物对热板致痛阈值的影响 见表4。

表4 透骨祛痹方乙醇提取物对热板致痛阈值的影响

表4 透骨祛痹方乙醇提取物对热板致痛阈值的影响

注:与空白组比较，①P＜0.05，②P＜0.01

组 别空白组阿司匹林组透骨祛痹方醇提取物高剂量组透骨祛痹方醇提取物中剂量组透骨祛痹方醇提取物低剂量组n 88888剂量（mg/kg）—0.05 0.66 0.33 0.17给药前痛阈值（s）16.04±3.58 16.24±5.75 15.91±6.82 16.26±3.69 16.05±4.27给药后痛阈值（s）30 min 16.34±6.97 32.05±12.93②34.40±4.88②31.09±16.41②26.50±8.43①60 min 17.36±4.68 39.25±12.30②60.91±18.41②40.12±16.58②35.42±13.39②90 min 17.78±11.23 48.25±11.77②67.79±9.97②46.59±10.71②41.59±13.72②

由表4可知，与空白组相比，给药前各组痛阈值差异无统计学意义（P＞0.05）；透骨祛痹方乙醇提取物高、中、低剂量组和阿司匹林组给药后30 min、60 min、90 min均可明显提升热板所致小鼠痛阈值（P＜0.05或P＜0.01）。

3.5 急性毒性试验结果 在给药后2 h内，小鼠未表现异常、死亡等情况。在给药20 h内，小鼠出现不同程度的蜷伏、毛发疏松、身体冰凉、活动减少、饮食减少等状况，给予5.035 mg/kg透骨祛痹方醇提取物的20只小鼠全部死亡，给予2.5175 mg/kg透骨祛痹方醇提取物的20只小鼠死亡数量为10只，给予1.1925 mg/kg透骨祛痹方醇提取物的20只小鼠全部存活。给药3天后，存活的小鼠活动正常，饮食正常。透骨祛痹方乙醇提取物对小鼠灌胃的LD50为3.1095 mg/kg（标准误为0.02726），LD50的95%置信区间为2.7497～3.5164 mg/kg。

4 讨论

膝关节滑膜炎是中老年患者常见的临床疾病，以疼痛、肿胀为常见症状。利用抗炎镇痛药物治疗本病是目前的主要手段。角叉菜胶致小鼠足肿胀是经典的急性炎症模型。角叉菜胶是从海藻中提取的一种含硫酸多糖物质，将其注射到小鼠后肢足跖部皮下，能使局部毛细血管扩张，血管通透性增高、渗出、水肿，产生一系列急性炎症的反应，常用于评价或筛选药物抗炎作用，在新药评价中应用广泛［6-9］。热板法是物理性疼痛刺激引起的应激组织反应，而醋酸扭体法是化学刺激物注入小鼠腹腔内引起的疼痛刺激反应，这两种方法是中枢镇痛和外周镇痛的经典模型，是评价和筛选镇痛药的常用模型［5，10］。本实验采用角叉菜胶致小鼠足肿胀急性炎症和背部皮下注射琼脂肉芽慢性炎症模型，研究透骨祛痹方醇提取物的抗炎作用，采用醋酸扭体法和热板镇痛法观察透骨祛痹方醇提取物的镇痛作用。

实验结果表明，透骨祛痹方醇提取物可显著抑制琼脂致小鼠肉芽肿；可显著抑制角叉菜胶致小鼠足跖肿胀，降低肿胀组织中PGE2含量；提示抑制局部组织PGE2合成或释放可能是其抑制炎症的途径之一。在镇痛作用方面，透骨祛痹方醇提取物可明显减少醋酸所致小鼠扭体反应次数，在给药30 min、60 min、90 min后均可显著提升热板所致小鼠痛阈值，作用与阿司匹林组相当。本方乙醇提取物的LD50为3.1095 mg/kg，表明具有一定的急性毒性作用。前期研究已证明透骨祛痹方主要含有有机酸、木脂素类和生物碱类成分，与其抗炎、镇痛作用可能相关，本课题组将进一步探索其具体作用机制。