基于肠道微生物的中药多糖与2型糖尿病关系研究进展＊

付志飞，杨 丽，尚 非，戴永娜，赵 鑫＊＊

（1.天津中医药大学中医药研究院 天津 301617；2.天津中医药大学临床实训教学部 天津 301617）

糖尿病是一种以高血糖为特征，常伴随脂肪、蛋白质代谢紊乱的代谢性疾病。据国际糖尿病联合会统计，自1980 年以来全球糖尿病发病率从4.7%上升到8.5%，增加近1 倍且呈年轻化趋势。糖尿病在我国成年人中发病率接近10%，患者超过1.1 亿，可引起心血管疾病、肾脏疾病等并发症，严重影响患者生存质量，给家庭和社会带来巨大的经济压力，成为我国主要公共卫生问题之一[1]。越来越多的研究表明，肠道微生物失调是糖尿病发生的重要诱因，因此调整菌群失调是防治2 型糖尿病的重要手段[2]。目前西药降糖药虽然起效迅速、降糖效果好，但存在作用靶点单一、胃肠道副反应以及肝肾毒性等，且单一化学成分在调节肠道微生物稳态方面不具有优势，而中药所含化学成分复杂，在调节微生物的组成和结构方面更有优势。中药多糖是中药水煎液重要组成成分之一，其干预治疗2 型糖尿病的研究频见报道，如灵芝多糖、人参多糖、桑叶多糖等，但是关于多糖口服后怎样吸收、体内如何发挥作用等一系列问题尚缺乏定论，而肠道微生物研究的进展，为多糖体内作用机制的研究打开了新视角。本文从肠道微生物的角度对中药多糖防治2型糖尿病的机制进行综述，以期为多糖药物的机制阐明和药物开发提供参考。

1 中药多糖与肠道微生物

糖类是重要的天然高分子化合物，广泛地存在于药用植物中，是植物细胞壁的主要组分，也是中药水煎液的重要活性化合物，按照分子量或是聚合度的大小不同分为多糖、寡糖和单糖。多糖通常是指20个以上单糖通过糖苷键连接在一起而形成的长链聚合物，分子量高，不溶于水，大多无味[3]。由于人体内缺少多糖消化酶，导致消化吸收多糖的能力十分有限。近年来，Jeffery Gordon、Willem M De Vos 等微生物学家发现肠道微生物能编码数千种碳水化合物活性酶，多糖生物活性的发挥有肠道菌群的参与，从而掀起了多糖与肠道微生物相互作用关系研究的热潮。肠道菌群能编码糖苷水解酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶以及糖苷转移酶，拟杆菌可降解相对广泛的多糖，厚壁菌门则倾向于代谢一系列特定的多糖[4,5]。

寡糖又称低聚糖，是由2-20个单糖通过糖苷键连接而成的低度聚合糖，分子量低，水溶性好，味甜。根据寡糖的生物学功能，可将其分为普通寡糖和非消化寡糖[6]。普通寡糖中有人们熟知的蔗糖、麦芽糖、乳糖等，又称营养性寡糖，可被机体消化吸收，但对肠道有益菌的生长并无促进作用，研究讨论较少；非消化寡糖如低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、菊糖及壳寡糖等，它们本身不能被机体胃酸、胃蛋白酶降解，可以通过小肠进入大肠，被肠道菌群消化后促进肠道内某些有益菌如乳酸杆菌和双歧杆菌的生长，产生有益作用。目前成功开发的有低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖以及低聚乳果糖等[7]。

中药多糖与肠道菌群相互作用，一方面，多糖作为肠道微生物发酵的碳源，为微生物的生长提供营养，因此通过改变多糖的种类可以重塑肠道菌群的结构，如低聚果糖可大幅促进肠道益生菌双歧杆菌生长[8]，Cheng等[9]人给小鼠喂食菊糖、米糠多糖或是二者混合物，发现单一种类的多糖可能增加有害物质二胺氧化酶和/或三甲胺N-氧化物，但营养均衡的混合多糖可改善菌群多样性；另一方面，肠道微生物将人体本身不能消化的多糖降解为多种活性代谢物，多糖可被肠道菌群降解，产生单糖和低聚糖，或乙醇、乳酸、琥珀酸等有机酸，并进一步形成乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）[10]。SCFAs 不仅是宿主及肠道菌群的能量来源，还能被多种外周组织利用，产生多种生理功能。多糖的体内降解与分子量、单糖组成、连接方式、聚合度、空间结构、溶解性以及肠道菌群对多糖的适应性等有关[11]。研究多糖和肠道菌群的相互作用对于揭示多糖的体内作用机制至关重要。

2 中药多糖与肠道微生物相互作用研究方法

研究中药多糖与肠道菌群相互作用常用的方法有：单一菌株培养法、全粪便培养法、悉生动物及无菌动物法等。单一菌株培养法的前提是分离得到单一的菌株，而事实上由于肠道菌群种类繁多且大多数为严格厌氧菌，分离纯化和培养相对困难，且鉴定过程复杂、耗时长。到目前为止，分离得到的肠道菌群还不足30%[12]。肠道菌群为一个生态系统，系统内的细菌既互利共生又相互制约，共同维持稳态，单一菌株法常常忽略菌群之间的相互作用，无法全面反映药物在肠道菌群的转化代谢过程。Jason 等对模式小鼠常用的6株 细 菌Clostridiumsp.，Lactobacillus intestinalis，Lactobacillus murinus，Eubacterium plexicaudatum，Pseudoflavonifractorsp.以及Parabacteroides goldsteinii两两共培养或是单培养，结合qPCR菌群分析以及1HNMR代谢物分析结果，发现单独培养和共培养细菌生长状态及代谢产物不同，共培养会提高细菌代谢物的利用效率，一种菌产生的代谢物可能被另一种细菌利用，如Clostridium sp.和Parabacteroides goldsteinii共培养会促进彼此生长，Parabacteroides goldsteinii产生的氨基酸会被Clostridium sp.利用[13]。

全粪便体外发酵法（in vitrofermentation）是研究中药多糖肠道菌群代谢转化特别推荐的方法[14,15]。碳水化合物发酵为结肠提供能量和碳源。人体各段肠道内的细菌是不同的，随着肠道蠕动，到达粪便排出体外，因此，粪便中含有消化道中的所有菌种。一般采用将新鲜粪便和含药培养基混合或是将粪便与培养基混合后再加入药物2种体外肠道微生物发酵的研究方法[16]。体外肠道发酵模型是研究益生元和益生菌的有力工具，批量发酵可以模拟肠道环境并实时取样，用来进行菌群干预的机制研究，具有样品用量少、不受饮食的影响、模型简单、高通量、快速、重现性好、无需伦理批准、可连续取样等优点，但由于肠道菌群大部分是厌氧菌，培养条件（厌氧）需严格控制。培养基的选取、培养条件的优化（发酵pH、时间等）是影响体外发酵的重要因素[13]。发酵所需多糖用量少，常采用TLC、HPLC、UPLC-MS、GC-MS、凝胶电泳等高灵敏的的检测手段动态检测发酵前后化合物的变化，采用q-PCR、16s rRNA高通量测序等方法检测发酵前后菌群的变化[17]。

除了体外模型外，体内动物模型，包括无菌动物、限菌动物等也被经常用于肠道菌群的研究[18]，相应地检测评价指标除了病理学、生化指标等，代谢物的变化也引起了科学家的广泛重视。中药的功效机制及其复杂，涉及到整体代谢网络，而肠道微生物不仅影响药物吸收，还能影响代谢并通过相应受体间接调控宿主代谢。肠道菌群参与宿主胆固醇、胆酸（特别是次级胆酸）、胆碱（如三甲胺-N-氧化物）、酚类、苯基、吲哚类及激素等的代谢，与宿主发生共代谢关系，形成一系列肠道菌群-宿主共代谢产物[19]。因此，常将宿主、菌群及宿主-菌群共同产生的代谢产物三者整体进行研究，评价肠道菌群介导的外源性物质对机体产生的影响。代谢组学技术可以从整体上解释中药与机体2个复杂体系的相互作用，可以实现对药物自身化学成分、代谢产物以及生物体的内源性代谢物3个水平同时进行分析，阐明药物吸收代谢后发生的变化、药效作用物质以及内源性代谢物变化，在中药药效物质基础、整体药效作用评价与作用机制研究中起重要作用[20,21]。代谢组学常用的方法包括：NMR、GC-MS、LC-MS等。大量文献表明，糖尿病患者的代谢组学发生显著改变，其中广泛涉及脂质代谢、氨基酸代谢和能量代谢[22]，包含一些宿主与肠道菌群共代谢产物如氨基酸、脂肪酸、胺类、糖类等。

3 肠道微生物在糖尿病中起重要作用

2 型糖尿病是糖尿病中最普遍的一种形式，以胰岛素抗性或活动紊乱为特征，发病机制可能与基因和生活方式相关。近年来研究表明，肠道微生物失调是2型糖尿病的重要诱因。肠道微生物可通过调节能量代谢、炎症反应以及其他化合物代谢等途径参与2 型糖尿病的发生和发展[23]。

3.1 能量代谢

肠道微生物能增加能量的摄入吸收。肠道微生物能将人体不易消化的碳水化合物降解成寡糖、单糖，进一步降解为H2，CO2，CH4，以及SCFAs其均可被宿主细胞作为能源物质吸收利用[24]。给予相同能量的高脂饲料，正常小鼠比无菌小鼠增重多，说明肠道微生物具有增加能量吸收的作用[25]。同样，给无菌小鼠分别移植ob/ob小鼠和正常小鼠盲肠微生物，发现移植肥胖小鼠微生物的无菌小鼠体重显著增加，说明改变肠道微生物可调节能量的摄入吸收[26]。单糖与SCFAs是肠道菌群代谢多糖的主要产物，单糖可以促进肝脏内源性甘油三酯的合成。与无菌小鼠相比，正常饲养的小鼠肝脏甘油三酯水平较高，脂肪生成转录因子固醇调节元件结合蛋白SREBP-1（sterol regulatory elementbinding transcription factor 1）和碳水化合物反应元件结合蛋白ChREBP（carbohydrate-Responsive Element-Binding Protein）以及它们的靶点乙酰辅酶A 羧化酶和脂肪酸合成酶表达升高[25]，甘油三酯在脂肪细胞中积累增加，导致肥胖。而用抗生素处理的菌群失调小鼠或无菌小鼠AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性增加，导致乙酰辅酶A羧化酶活性降低，肝脏、肌肉和脂肪组织中依赖AMPK的脂肪酸氧化作用增强，则抑制肥胖的发生[27]。此外，血管生成素样4（angiopoietin-like protein 4，Angptl4）负责血液中的甘油三酯的清除，是脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）的抑制剂。研究表明，肠道微生物可通过抑制Angptl4 基因的表达，进而抑制肠脂肪酶活性，降低脂质的吸收，抑制肥胖[28]，反之，肠道微生物失调则促进肥胖的发生。此外，肠道微生物的重要代谢产物SCFAs 可为结肠粘膜细胞提供能量，促进脂肪的合成和贮存。

3.2 炎症反应

2 型糖尿病是以持续性炎症为特征的代谢性疾病，2008年鲁汶大学的Cani等提出了2型糖尿病的“代谢性内毒素血症”学说，第一次将2型糖尿病患者体内的慢性炎症反应与肠道菌群联系起来[29]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是存在肠道革兰氏阴性细菌（G-）细胞壁中的一种内毒素。失衡的肠道菌群产生的LPS、三甲胺N氧化物等内毒素可通过通透性改变的肠上皮屏障进入血液，被免疫细胞识别后产生多种炎症因子，使得机体进入炎症状态，从而产生系统炎症反应、葡萄糖耐受、肥胖以及脂肪组织炎症等一系列代谢异常反应。Cani 等研究发现，利用抗生素处理高脂饮食喂养小鼠，可降低肠漏，增加紧密连接蛋白的表达，降低环境中LPS以及炎性因子的水平，从而提高葡萄糖耐受及胰岛素敏感性[29]。除了LPS，其他微生物成分，如细菌细胞壁成分肽聚糖也可能诱导糖尿病的发生。无菌小鼠分别移植野生型大肠杆菌和突变型大肠杆菌，发现只有野生型大肠杆菌促进血浆LPS 水平的增加，但二者均可降低葡萄糖耐受及促进脂肪增加。作者推测，可能是细菌表面的肽聚糖，激活肽聚糖受体核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白（nucleotide oligomerization domain 1，NOD-1），诱导小鼠炎症反应及胰岛素抵抗[30]。

3.3 代谢

肠道微生物不仅影响食物药物吸收，还能影响宿主代谢。肠道菌群参与宿主胆固醇、胆酸（特别是次级胆酸）、胆碱（如三甲胺-N-氧化物）、酚类、苯基、吲哚类及激素等的代谢，与宿主发生共代谢关系，形成一系列肠道菌群-宿主共代谢产物。

3.3.1 短链脂肪酸SCFAs

SCFAs 又称为挥发性脂肪酸，是由1-6 个碳原子组成的有机脂肪酸。SCFAs主要由未消化吸收的食物残渣中的碳水化合物经结肠内微生物发酵而产生，主要包括乙酸、丙酸、丁酸。普氏菌（Prevotella）和拟杆菌（Bacterioides）等广泛参与碳水化合物的酵解，SCFAs可通过调节代谢、抑制树突状细胞和激活脂肪酸受体途径直接或是间接的调节T 细胞分化，进而促进Th1或是Th17 细胞的产生，SCFAs 还能刺激T 细胞产生抗炎因子IL-10，增强机体的免疫反应，降低2 型糖尿病的发生[31]。肠道L 细胞上存在许多SCFAs 受体，如GPR41/43（Gprotein-coupled receptors 41and 43）等，GPR43能够促进L-细胞分泌（glucagon like peptide-1）GLP-1（glucagon like peptide-1），促进胰岛素的分泌，增加胰岛素敏感性。SCFAs能降低脂肪和肝脏组织的过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferatoractivated receptor）PPARγ，提高胰岛素敏感性，降低肥胖或2 型糖尿病的发生[32]。因此，以产SCFAs 菌为靶点，进行干预可以防治2 型糖尿病。赵立平研究团队从给予高膳食纤维的干预的人肠道微生物中鉴定出了15 株有利于增加胰岛素分泌和提高胰岛素敏感性的“短链脂肪酸”产生菌[33]。

3.3.2 支链氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA）

BCAA是指α碳上含有分支侧链的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，属于必需氨基酸，是机体内重要的营养代谢信号分子，在维持肠道粘膜免疫系统及肠道粘膜完整性方面发挥重要作用[34]。肠道中的普雷沃氏菌（Prevotella copri）和普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）广泛参与BCAA 的合成。BCAA 与糖尿病的联系目前研究还未完全清楚。Peter 等研究发现，BCAA以及芳香族氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸）与男性的胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）相关，而糖异生氨基酸包括丙氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、精氨酸和色氨酸与IR 没有关联[35]。在另一项纳入1302 名年龄为20岁以上人的Meta分析中发现，饮食中摄入较高水平的BCAA 能够增加IR 的风险，加速代谢综合征及糖尿病的发展进程，但是与高胰岛素血症及β细胞功能失调无显著关联[36]。

3.3.3 胆汁酸及胆碱代谢

胆汁酸是重要的信号分子，主要是通过2 种胆汁酸的受体——法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）与胆汁酸G 蛋白偶联受体TGR5（G-protein-coupled bile acid receptor Gpbar1）参与糖脂代谢[37]。从来源或生成部位可将胆汁酸分为初级胆汁酸和次级胆汁酸，在肝脏内由胆固醇生成的称为初级胆汁酸，而在肠道微生物的作用下转变成的为次级胆汁酸[38]。肠道微生物，尤其是梭菌属微生物含有将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸的酶，使用抗生素杀死部分肠道微生物后，可增加小鼠初级胆汁酸，降低次级胆汁酸的水平[39]。研究表明，胆汁酸代谢在2型糖尿病人中发生了变化，而通过调节2型糖尿病患者的胆汁酸种类及含量可以改善患者血糖水平[40]。Jones 等研究发现肠道菌群失调，含有胆汁盐水解酶肠道微生物减少，导致胆汁酸代谢失调，诱导糖脂代谢疾病的发生[41]。因此，调节参与胆汁酸代谢的肠道微生物可能是潜在的糖尿病治疗靶标。2011年，王则能等首次发现肠道微生物代谢产物氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）能促进动脉粥样硬化的发生，随后激发了科学家对TMAO 与心血管疾病关系的研究的热情[42]。最近，一项纳入1.5万名受试者的meta 分析研究表明，糖尿病患者血浆TMAO 水平高于健康人，且TMAO 水平与糖尿病风险呈正相关，血浆中TMAO 浓度每增加5 μmol·L-1，糖尿病患病率就增加54%，但是其具体作用机制还有待进一步研究[43]。

4 基于肠道微生物的中药多糖防治糖尿病研究现状

多糖具有广泛的药理活性，其干预治疗糖尿病的研究频见报道。多糖可通过调节肠道菌群和改变肠道粘膜免疫屏障、调节代谢产物等发挥抗糖尿病作用，但以肠道菌群为靶点的中药多糖防治糖尿病的机制研究尚不明确，大多数文献在对多糖降糖作用进行研究的同时仅仅对疾病指标与肠道微生物的相关性或多糖对肠道微生物的影响进行了考察，大多缺乏对其作用机制及因果关系的深入探究。中药尤其是补益类中药，富含多糖，目前黄芪、党参、麦冬、灵芝、枸杞、山药、黄精等均有防治糖尿病同时调节肠道微生物的文献报道（表1）。

菊粉能够降低链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）联合高脂饮食诱导的糖尿病大鼠空腹血糖水平、缓解葡萄糖不耐受，提高血清胰高血糖素样蛋白-1（glucagon-like Peptide-1，GLP-1）水平，降低血清、附睾脂肪组织IL-6（interleukin-6，IL-6）水平以及肝脏磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，Pepck）和葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基（glucose-6-phosphatase catalytic subunit，G6pc）的 表达。16s rRNA 测序结果表明，菊粉能提高糖尿病大鼠厚壁菌门的比例，降低拟杆菌门的比例，显著提高益生菌乳酸杆菌以及产SCFAs 菌如毛螺菌，Phascolarctobacterium和拟杆菌的丰度，降低产LPS 产生菌脱硫弧菌的丰度[51]。Chen 等研究发现，桑葚多糖能够降低糖尿病db/db小鼠体重，降低血糖水平，提高葡萄糖耐受量，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）以及过氧化氢酶（catalase，CAT）活性，升高高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、降低总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDLC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）以及游离脂肪酸水平降低，改善肝、肾、胰腺的损伤，原因可能与桑葚多糖调节肠道菌群，提升拟杆菌水平，降低肠道微生物的多样性，尤其能上调拟杆菌，乳酸菌属，Allobaculum和阿克曼属细菌丰度有关[52]。Sheng等研究报道，桑叶能通过抑制非酯化脂肪酸信号通路和调节肠道菌群修复与胰岛素抵抗、糖尿病相关的肠菌（拟杆菌门、变形菌门、梭菌纲等）来发挥降血糖作用[53]。南瓜多糖通过调节肠道菌群和促进短链脂肪酸的吸收来提高2型糖尿病大鼠胰岛素耐受，降低血清葡萄糖水平、总胆固醇水平以及低密度脂蛋白水平，提高高密度脂蛋白水平，增加拟杆菌、普雷沃氏菌等丰度，调节肠道菌群。相关分析研究表明菌群的变化与丁酸含量显著相关[51]。目前研究多集中于动物实验，但也有部分临床研究，其临床研究结果显示高纤维饮食（每日摄入50 g膳食纤维，其中50%为可溶性膳食纤维）可同时降低2 型糖尿病人血糖和血脂水平[55]。

表1 中药多糖对2型糖尿病防治作用及对肠道微生物的影响

台湾长庚大学研究团队较早涉及了中药多糖与肥胖糖尿病以及肠道微生物之间因果关系的研究。给予小鼠灵芝子实体多糖提取物15 d，发现灵芝多糖降低小鼠肠道菌群操作分类单元OTU（operational taxonomic units）多样性并显著重塑肠道菌群的组成，显著增加小鼠肠道内可抗肥胖、产短链脂肪酸、降解多糖、产乳酸细菌的丰度，调节肠道微生物作用助力生物活性的发挥[56]；将赤芝的水提物添加到高脂饮食诱导的肥胖小鼠食物中，发现肥胖小鼠表现出体重下降、炎症改善、胰岛素敏感性增加等获益表型，并且小鼠的肠道菌群生态紊乱也得到了逆转，除此之外，小肠屏障的完整度得以维持，代谢性内毒素水平降低。该团队还通过粪便移植的方法将赤芝水提物给药小鼠粪便移植到高脂饮食诱导肥胖小鼠中，其也表现出体重下降，肠道菌群改善现象，阐明肠道微生物是灵芝发挥减肥作用的原因[57]；另有文献报道灵芝多糖可降低高脂饮食诱导胰岛素抵抗小鼠血浆中的胰岛素浓度，逆转胰岛素抵抗，缓解低度炎症反应，并降低脂肪组织中的脂肪分解，抑制TNF-α及IL-6的mRNA表达，减少血浆甘油三酯及非酯化脂肪酸的外流，作用可能与调节2 型糖尿病发展相关的肠道微生物组成相关[58]。

随着组学技术的发展，人们不再单纯关注中药多糖引起肠道微生物的多样性变化，而更加关注多糖和肠道微生物作用引起的代谢产物的变化及作用，因此代谢组学技术和方法被广泛用于阐述多糖治疗糖尿病的作用机制。采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱代谢组学技术对正常大鼠、STZ 诱导的糖尿病大鼠以及给予葫芦巴半乳甘露聚糖的糖尿病大鼠尿液、血清样本进行分析，结合主成分分析、正交偏最小二乘判别分析等统计方法与发现葫芦巴发挥作用的14 个潜在生物标志物，涉及组氨酸、色氨酸、能量、苯丙氨酸、鞘脂、糖脂、花生四烯酸代谢，而这些通路均有肠道微生物广泛参与[59]。

5 展望

长期以来，人们一直认为中药小分子成分是发挥药效的物质基础，而多糖成分分子量大，口服不易吸收，被认为对药效贡献小。加之，多糖本身分离纯化效率低、结构多样、鉴定复杂费时、缺少发色基团或荧光基团、入血成分检测困难且鲜有市售标准品[60]，虽然中药多糖在糖尿病防治方面有很多应用：降低血糖、调节脂质代谢、纠正能量平衡，但“以糖降糖”作用机制一直没有阐明。肠道微生物的研究、多糖与微生物的互作研究为阐明多糖生物学机制提供了新方向；多组学技术，尤其是代谢组学技术为多糖对代谢性疾病影响的研究提供了新方法，随着抗糖尿病机制研究的深入，中药多糖在糖尿病的防治中必将发挥重要作用。