中药提取物对诺如病毒灭活的研究＊

王书菁，施晓峰，廖宁波，吴康军，周文婕，卢宇剑，程东庆＊＊

（1.浙江中医药大学医学技术学院 杭州 310053；2.浙江省疾病预防控制中心 杭州 310051）

诺如病毒（Norovirus,NoV）属于杯状病毒科（Caliciviruses）的诺瓦克病毒属，诺如病毒感染性极强，是引起人类急性胃肠炎的最常见病原微生物之一[1]。中国自1995年报告首例诺如病毒感染病例后，国内许多地区多次暴发诺如病毒感染性急性胃肠炎案例[2]。2016 年10 月17 号，哈尔滨医科大学接到43 名学生反应消化系统不适，出现呕吐、发热、腹泻的症状，事后确诊39 名为诺如病毒感染＊＊＊中新网.http：//news.jxntv.cn/2016/1017/8177862.shtml。2014 年1 月下旬，浙江嘉兴市海宁、海盐两地部分学校出现聚集性学生恶心呕吐腹泻等症状，经当地疾控中心检测确定为诺如病毒感染＊＊＊＊人民网.http：//politics.people.com.cn/n/2014/0220/c70731-24414205.html。目前诺如病毒尚未有疫苗面世，也没有特异的抗病毒药物[3]。诺如病毒已成为一个日益严重的公共卫生问题。

资料显示，G Ⅱ型诺如病毒（Genogroups ⅡNorovirus，GⅡ.NoV）是中国的流行优势株，一般通过粪-口传播。粪-口传播包括了食源性、水源性以及人-人直接接触传播[4]。食物中的诺如病毒灭活一般采用热高压即可灭活[5]，国内外针对诺如病毒的灭活研究主要是水体中的诺如病毒。在传统水处理工艺中，国内外均采用总大肠菌群或大肠菌群作为评价水处理效果的指示微生物，水处理中病毒的安全问题未得到应有的重视[6]，而且水体很难做到完全清除病毒，因此开发和完善诺如病毒的检测及灭活技术，对诺如病毒的预防控制将起到重要作用。

本实验研究中药提取物对诺如病毒的灭活效果，为减少诺如病毒污染、保障公共卫生健康提供实验支撑。

1 材料与方法

1.1 实验样品

诺如病毒阳性样品：由浙江省疾病预防控制中心提供，样品保存于-80℃备用；

中药材：鱼腥草（Houttuynia cordata）购自兴宁市长城医药有限公司泰安药行，天然蜂胶原胶（Propolis）购于江苏泰安市农家养蜂园。

1.2 实验仪器

SKY-200B型恒温培养摇床；MLS-3020CH型高压蒸汽灭菌锅；ABI 7500 荧光定量PCR 仪；1300 系列A2型生物安全柜；金属浴；紫外杀菌仪；W2010B 型数控恒温水浴锅；TC-15 恒温电热套；R-20J 旋转蒸发仪；SHZ-D-III 型循环水真空泵；SHP 250 型生化培养箱；DHG 9420A 型电热恒温鼓风干燥箱；DR/2400 型便携式分光光度计等。

1.3 实验试剂

Qiagen RNeasy Mini Kit（74104，Qiagen）、QIAamp Viral RNA Mini Kit（52904，Qiagen）、One Step PrimescriptTMRT-PCR Kit（RR064A，Takara）、人诺如病毒抗原ELISA检测试剂盒（18584，上海江莱生物技术有限公司）等。

1.4 实验方法

1.4.1 中药提取物的制备[7-10]

中药材清洗干燥后打成粗粉用于提取。

水提法：称取50 g的药物粉末，加蒸馏水1 L，95℃提取4 h，过滤除渣，取滤液。滤渣中再加蒸馏水1 L，按上法再次抽提2 h后过滤除渣，取滤过液，合并两次滤过液，旋转蒸发仪浓缩干燥。

醇提法：称取50 g 的药物粉末，采用95%乙醇提取，按照1∶10的料液比，95℃提取4 h，过滤除渣，取滤液。滤渣中再加95%乙醇1 L，按上法再次抽提2 h 后过滤除渣，取滤过液，合并两次滤过液，旋转蒸发仪浓缩干燥。

1.4.2 RT-qPCR检测病毒含量

采用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取样品中的核酸为模板，用One Step PrimescriptTMRT-PCR Kit 试剂盒进行反应。引物和探针均由上海生工有限公司合成，引物[11,12]序列（表1）、反应体系（表2），42℃逆转录30 min 后95℃预变性2 min，变性5 s、55℃退火35 s 共40个循环。

表1 RT-qPCR引物和探针序列

表2 RT-qPCR反应体系

1.4.3 中药提取物对诺如病毒灭活的量效、时效关系研究

量效关系研究：中药提取物（浓度1、10、25、50 mg·mL-1）室温下与100 μL 的病毒悬液孵育30 min，设立溶剂对照组（只加100 μL的DMSO和100 μL的病毒悬液）；空白对照组（加入100 μL 的无菌水和100 μL的病毒悬液），应用RT-qPCR 进行检测，检出Ct 值越大，灭活效果越明显。

时效关系研究：中药提取物（浓度50 mg·mL-1）室温下与100 μL 的病毒悬液孵育一定时间（0、15、30、60、120 min），设立溶剂对照组（只加100 μL 的DMSO和100 μL的病毒悬液）；空白对照组（加入100 μL的无菌水和100 μL 的病毒悬液），应用RT-qPCR 进行检测，检出Ct值越大，灭活效果越明显。

1.4.4 灭活机理一——对诺如病毒蛋白外壳的破坏作用研究

中药提取物（浓度1、10、25、50 mg·mL-1）室温下与100 μL的病毒悬液孵育30 min，设立溶剂对照组（只加100 μL的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和100 μL的病毒悬液）；空白对照组（加入100 μL的无菌水和100 μL 的病毒悬液），用ELISA 试剂盒检测结构未被破坏的完整病毒蛋白，检测OD值越低说明对病毒的破坏作用越好。以紫外辐射法9 000 μ W·cm-2作用30 min、二氧化氯以10 mg·mL-1的浓度作用30 min、5%双氧水作用30 min作为对照。

1.4.5 灭活机理二——对诺如病毒核酸的破坏作用

病毒灭活处理方法同上，提取病毒核酸，逆转录PCR（RT-PCR）扩增GII.NoV 特异性片段,琼脂糖凝胶电泳检测各处理组核酸序列的完整性，扩增引物（表3）、扩增反应体系（表4），42℃逆转录30 min后，95℃预变性5 s、变性35 s、55℃退火共40个循环，扩增产物由上海生工生物公司测序，比较各组序列的完整性，考察对核酸的破坏作用。

表3 GII.NoV 特异性片段扩增所用引物

表4 GII.NoV 特异性片段扩增体系

1.4.6 统计学分析

采用SPSS24.0 统计软件进行分析，数据用均数±标准差（±s)表示。统计学方法采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01 为差异有显著性意义。

2 结果及分析

2.1 中药提取物对病毒灭活的量效关系

中药提取物与GII.NoV 作用30 min，在0-50（mg·mL-1）剂量范围内，与对照组相比，蜂胶醇提物和鱼腥草水提物均对诺如病毒有一定灭活作用，且随着浓度提高，效果越明显。

2.2 中药提取物灭活病毒的时效关系

以50 mg·mL-1的剂量与GII.NoV 作用0、15、30、60、120 min，随着灭活时间的增加，病毒量不断降低；30 min到1 h之间灭活达到最大效果，作用1-2 h之间，灭活效果增加不再明显。

2.3 中药提取物/紫外/二氧化氯/双氧水方法灭活效果的比较

比较50 mg·mL-1蜂胶醇提物灭活30 min、50 mg·mL-1鱼腥草水提物灭活30 min，辐射剂量9 000 μ W·cm-2紫外作用30 min，10 mg·mL-1二氧化氯作用30 min、5%双氧水作用30 min（图1），五种方法对水中GII.NoV 均有显著灭活效果，10 mg·mL-1二氧化氯作用30 min 后可以灭活85.13%的GII.NoV，9000 μ W·cm-2的紫外作用30 min后灭活率达到96.7%、5%双氧水作用30 min后灭活率达到81.09%；而蜂胶醇提物和鱼腥草水提物作用30 min后可以灭活97.03%和97.88%的病毒，略高于其他灭活方法。

表5 中药提取物对GII.NoV的灭活作用（±s，n=5）

表5 中药提取物对GII.NoV的灭活作用（±s，n=5）

表6 中药提取物作用时间对GII.NoV的灭活影响（±s，n=5）

表6 中药提取物作用时间对GII.NoV的灭活影响（±s，n=5）

注：与对照组比较，P＜0.05

图1 五种灭活方法对GII.NoV的灭活效果

2.4 五种灭活方法对诺如病毒蛋白外壳的破坏作用

蜂胶醇提物、鱼腥草水提物、紫外线、二氧化氯和双氧水处理诺如病毒后通过ELISA检测结构未被破坏的完整病毒蛋白，其OD 值结果（表7）。与对照组相比，鱼腥草水提物、紫外线、二氧化氯和双氧水处理OD值均明显下降，说明病毒外壳蛋白表面抗原受到了破坏，其中尤以二氧化氯和紫外效果最为明显；但是蜂胶醇提物对诺如病毒颗粒的破坏作用不明显。

表7 五种灭活方法处理后病毒液ELISA和RT-qPCR双重检测结果

图2 几种灭活方法处理前后的诺如病毒RT-PCR琼脂凝胶电泳分析图

表8 五种方法灭活处理后3对引物的扩增结果

图3 ORF1的蛋白编码位点

表9 消毒处理后诺如病毒ORF1核酸突变情况

2.5 5种灭活方法对诺如病毒核酸的破坏作用

5种方法灭活处理后，提取病毒核酸，扩增特异性片段，扩增结果（图2，表8），鱼腥草组和双氧水组3个片段均未能扩增成功，蜂胶组、紫外组仅片段2扩增成功，二氧化氯组则成功扩出了第1、2片段。

RT-PCR 扩增产物经上海生工生物公司测序，利用DNAstar分析测序片段，为更好地观察突变的程度，分别定义了保守点、突变点和高突变点，保守点碱基没有发生变化，含有3 个碱基以内突变的为突变点，3 个以上碱基发生突变的为高突变点，分别计算突变率从而可以清楚地发现序列的变异情况。

图2 和表8 可见ORF2 和ORF3（片段3）均未能扩增出，只有部分ORF1（片段1和片段2）能完整扩增出，因此笔者着重对ORF1 上的6 个蛋白区域进行详细分析。ORF1 结构如图3 所示，5’-N 端开始依次分别是p48、NTPase、p22、VPg、Pro及RdRp。

将有0-5 个碱基突变的定义为“+”，有5-10 个碱基突变的定义为“++”，将有10个以上碱基突变的定义为“+++”。5 种灭活方法处理后，ORF1 上各位点的突变情况（表9）。

3 讨论

我国贝类产量已连续10多年名列世界第一，是我国水产品的重要组成部分。然而由于我国的水产品污染严重，检测技术滞后，相关卫生标准不能和国际接轨等种种因素，水产品出口屡次遭遇国际技术性贸易壁垒的限制，其中一项就是诺如病毒不得检出。2004年5月，新加坡农业食品兽医局(Agri-Food and Veterinary Authority of Singapore，AVA)从我国三批出口冻牡蛎检出诺如病毒，货物被退回。在此之前的2002 年，美国农业部用RT-PCR方法从进口中国文蛤中检测出诺如病毒，导致中国出口到美国的文蛤受阻，使我国的贝类养殖业蒙受重大损失。

对贝类食源性病毒的灭活研究起步比较晚，研究的文章并不多，缺乏系统性。而诺如病毒对各种外界理化因素都有较强的抵抗力，在室温条件下于pH 为2.7 的环境中暴露3 h 仍具有感染性[13]；酒精处理诺如病毒后，病毒无法被灭活[14]；在含3.75-6.25 mg·L-1氯的普通饮用水中，诺如病毒仍表现出一定的耐受性[15]；在10 mg·L-1高浓度氯离子（处理污水采用的氯离子）存在时才能被灭活[16]。诺如病毒对高温、冰冻、高压等也有一定的抵抗力：60℃作用30 min后，病毒不能完全灭活[17]；将含有诺如病毒的食品基质冰冻6个月后，其活性几乎不受影响。

笔者选取蜂胶醇提物和鱼腥草水提物对GII.NoV的灭活规律进行研究。在以0-50 mg·mL-1的中药提取物作用30 min时，随着浓度的增加，对诺如病毒的灭活效果越好。室温下，蜂胶醇提物和鱼腥草水提物以50 mg·mL-1为作用浓度，GII.NoV的减少率在30 min-1 h时达到最高，分别为1.16-1.77 log10和1.67-2.29 log10，表明中药提取物对诺如病毒的灭活效率存在一定的时效性。蜂胶醇提物和鱼腥草水提物作用30 min后可以灭活97.03 %和97.88 %的病毒，略高于其他灭活方法。在贝类收获后，预先用含有上述提取物的溶液进行浸泡或者销售运输过程中的储藏水里加入上述提取物，将有助于杀灭诺如病毒，有效地保障我国水产品卫生安全，全面促进我国水产品经济的持续发展。