石斛多糖对SHR氧化应激反应和晚期糖基化终产物代谢的影响

曾德创 陈宏明 潘兴寿 唐汉庆 梁烨 邹才华 李天资

【摘要】 目的 探讨石斛多糖对自发性高血压大鼠（SHR）氧化应激和晚期糖基化终产物（AGE）代谢的药效及其剂量。方法 提取石斛多糖，将SHR大鼠随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组四个组，对照组给予开水，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别给予石斛多糖100 mg/d、300 mg/d、500 mg/d，干预 2个月，比较干预后各组超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、AGE、可溶性AGE受体（sRAGE）和全长AGE受体（RAGE）mRNA水平。结果 对照组SOD、CAT和MDA平均水平分别为（111.26±23.36）U/L、（59.58±13.48）U/L和（19.77±1.61） μmol/L，低剂量组为（151.18±23.76）U/L、（63.36±12.40）U/L和（10.95±2.07） μmol/L，中剂量组为（177.03±29.00）U/L、（76.35±11.20）U/L和（8.83±1.91） μmol/L，高剂量组为（182.77±21.62）U/L、（85.83±11.58）U/L和（6.94±1.84） μmol/L。与对照组比较，低剂量组SOD水平较高，MDA水平较低，差异有统计学意义（P<0.01），中剂量组和高剂量组SOD、CAT水平较高，MDA水平较低，差异有统计学意义（P<0.01）。对照组AGE、sRAGE和RAGE mRNA平均水平分别为（6.43±0.78）mg/L、（1.09±0.18）mg/L和（0.94±0.11），低剂量组为（6.40±0.80）mg/L、（1.41±0.19）mg/L和（0.90±0.08），中剂量组为（5.99±0.67）mg/L、（1.70±0.20）mg/L和（0.84±0.15），高剂量组为（4.67±0.69）mg/L、（1.95±0.22）mg/L、（0.54±0.10）。与对照组比较，低剂量组、中剂量组sRAGE水平较高，差异有统计学意义（P<0.01），高剂量组AGE、RAGE mRNA水平较低，sRAGE水平较高，差异有统计学意义（P<0.01）。石斛多糖对MDA、SOD、AGE、sRAGE和RAGE mRNA平均水平有剂量效应关系，纠正SHR氧化应激功能紊乱的有效剂量为300 mg/d;纠正SHR晚期糖基化终产物及其受体功能紊乱的有效剂量为500 mg/d。结论 石斛多糖可有效缓解SHR的氧化应激功能紊乱，降低AGE水平，提高sRAGE水平，降低RAGE基因的活化，对缓解SHR的血管重塑有积极的作用。其药效有剂量效应关系，中等剂量可有效改善氧化应激症状，高剂量能改善AGE其受体症状。

【关键词】 石斛多糖;氧化应激;自发性高血压;晚期糖基化终产物;晚期糖基化终产物受体

中图分类号：R282.71 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.09.002

晚期糖基化终产物（Advanced glycation end products，AGE）能够和身体的组织细胞相组合，导致慢性退化性疾病的发生，是全球医学界最为热门的研究领域之一，AGE受体（Receptor for Advanced Glycation End-product，RAGE）是细胞表面分子的免疫球蛋白超家族成员之一，与AGE及蛋白质分子相互作用参与氧化应激，高水平的AGE可促进RAGE的表达，诱导细胞信号转导与促进动脉粥样硬化（AS）的发生和发展有关[1]。可溶性RAGE（Soluble receptor for advanced glycation end products，sRAGE）与RAGE结构相似，可竞争性与AGE结合，对保护血管细胞，改善AS进程有积极的作用，成为临床药学关注的热点[2]。石斛（Dendrobium）含有丰富的酚类、类萜类和含氮类等重要药用成分，具有滋阴清热，抑制炎症反应，增强免疫力等功效，在AS治疗中发挥了积极的作用，但其作用的靶点及其机制还不完全清楚[3]。为探讨石斛对AS的疗效及其机制，本文观察石斛多糖干预自发性高血压大鼠（SHR）后其超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、AGE、sRAGE和腹主動脉平滑肌RAGE mRNA表达水平的变化情况。

1 材料与方法

1.1 铁皮石斛多糖

采用新鲜铁皮石斛（广西根辽生物技术有限公司提供），经本校何思陆主任药师鉴定确认。多糖提取按文献[4]：取新鲜铁皮石斛茎1000 g，100℃杀青30 min，60℃烘箱烘干24 h，100目粉碎机粉碎，80℃热水浸提2 h，离心、抽滤、浓缩至原有体积的1/6，醇沉24 h，离心，真空干燥。热水回流加纤维素酶（Cellulase）纯化，水浴加热浓缩至含生药量为1 g/100 mL的药液，杀菌，贮存于4℃冰箱内备用。

1.2 动物喂养与药饲

（1）SHR和饲料：SHR大鼠由中山大学北校园实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK（粤）2017-0081。选购（2 m±2 d）月龄雄性SHR大鼠48只，普通级。鼠饲料丸由上海新奇特种饲料厂提供。（2）喂养方法：鼠饲料丸架式笼养，室温（20±2）℃，相对湿度（75±5）%，光照明暗各12 h交替，喂养至（8 m±2 d）月龄，平均体重为（352±5） g时给予药物干预。（3）分组药饲：将48只SHR大鼠随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组共四组，每组12只同一笼饲养。（4）药物剂量：根据2010年版《中国药典》成人（70 kg）推荐剂量10 g/d，SHR体重0.35 kg，按照人用量推算动物给药量，SHR等效剂量约为人的6.3倍，本研究用石斛剂量为：低剂量组100 mg/d，中剂量组300 mg/d，高剂量组500 mg/d。（5）给药方法：低剂量组口腔给石斛多糖药饮100 mg/d（取10.0 mL药液加水40 mL）;中剂量组口腔给石斛多糖药饮300 mg/d（取30.0 mL药液加水10 mL）;高剂量组口腔给石斛多糖药饮500 mg/d（取50.0 mL药液），每天1次。对照组口腔予开水50.0 mL/d。四组均等量喂鼠饲料丸，饮用水自由饮用，连续2个月。

1.3 标本采集

于干预后麻醉SHR进行标本采集。（1）麻醉方法：碘伏消毒，以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。（2）血液标本采集：剃去腹部的毛，解剖，切腹壁打开腹腔，从腹腔静脉取血0.5 mL，低温分离取血清。（3）标本采集：剪取腹主动脉平滑肌15 mm×3 mm组织，剪成5 mm×3 mm共3小块，分别置于3个冻存管，于30 min内液氮固定4 h，移至-70℃冰箱保存备检。

1.4 标本检测

SOD活性用黄嘌呤氧化酶法测定，CAT用钼酸铵法测定，MDA用硫代巴比妥酸法测定，sRAGE用ELISA法测定，试剂盒由杭州沃森生物技术有限公司提供，用美国BIO RAD 550型酶标仪检测，严格按检测方法和程序进行。

1.5 RAGE mRNA表达检测

用RT-PCR法，取100 μL腹肌匀浆，用Trizol试剂提取总RNA，氯仿和异丙醇抽提。紫外分光光度仪和琼脂糖电泳鉴定RNA的浓度和纯度，取10 μL，逆转录合成cDNA，-70℃冻存备用。取5 μL逆转录产物进行PCR扩增反应，并以β-actin为内参对照。根据Gene Bank人RAGE基因（Gene Bank登录号AB036432）设计RAGE基因引物，由杭州联川生物技术有限公司设计合成。RAGE基因及其管家基因序列及扩增长度见表1。PCR反应条件：55℃逆转录反应60 min，94℃变性2 min→94℃30 s→55℃30 s→72℃1 min，共30循环，72℃延伸7 min。胶回收试剂盒回收目的基因片段。PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像仪采集图像，PCR仪获得产物Ct值，采用2-ΔΔCt相对定量计算公式计算分析。

1.6 统计学方法

应用SPSS 20.0版本软件进行统计处理，计量数据用（±s）表示。多组资料比较用单因素方差分析，组间比较用LSD-t检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 石斛多糖对SHR大鼠SOD、CAT和MDA水平的影响

与对照组比较，低剂量组SOD水平较高，MDA水平較低，差异有统计意义（P<0.01），中剂量组和高剂量组SOD、CAT水平较高，MDA水平较低，差异有统计意义（P<0.01）;与低剂量组比较，中剂量组和高剂量组SOD、CAT水平较高，MDA水平较低，差异有统计意义（P<0.01）;与中剂量比较，高剂量组MDA水平较低，差异有统计意义（P<0.01）。提示石斛多糖能有效纠正氧化功能紊乱，表现为提高SOD、CAT水平，降低MDA水平，治疗SHR氧化应激的有效剂量为石斛多糖300 mg/d，连用2个月，将剂量提高到500 mg/d，其纠正氧化功能紊乱效果无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.2 石斛多糖对SHR大鼠AGE、sRAGE和RAGE mRNA的影响

与对照组比较，低剂量组、中剂量组sRAGE水平较高，差异有统计学意义（P<0.01），高剂量组AGE、RAGE mRNA水平较低，sRAGE水平较高，差异有统计学意义（P<0.01）。与低剂量组比较，中剂量组sRAGE水平较高，差异有统计学意义（P<0.01），高剂量组AGE、RAGE mRNA水平较低，sRAGE水平较高，差异有统计学意义（P<0.01）。与中剂量组比较，高剂量组AGE、RAGE mRNA水平较低，sRAGE水平较高，差异有统计学意义（P<0.01）。提示石斛多糖能有效纠正晚期糖基化终产物及其受体功能紊乱，表现为提高sRAGE水平，降低AGE和RAGE mRNA水平。石斛多糖有效纠正SHR大鼠AGE及其受体功能紊乱的有效剂量为500 mg/d。见表3。

3 讨论

有关AGE及RAGE的结构及其对各种疾病病理机制作用的共识正在不断更新，AGE是一种有高度活性的对机体有害的羰基化合物，营养物质经过美拉德（Maillard）反应产生的终末产物，AGE在非酶促条件下，营养物质中的蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子游离的氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰等美拉德反应后产生的，首先大分子末端的还原性氨基与还原糖分子中的醛基发生加成反应，形成希夫碱（Schiff bases）;其次希夫碱再发生阿马道里（Amadori）重排，形成早期糖基化产物醛胺类;再次经醛胺类脱水，重排反应生成乙二酸（草酸）、3-脱氧葡萄糖醛酮（3-DG）和甲基乙二醛（丙酮醛）等AGE[5]。体内AGE的主要来源之一是通过进食将AGE摄入体内，另外当体内葡萄糖浓度异常增高时，体内AGE的合成加速，分解减缓[6]。当AGE异常增高时，细胞表面的RAGE与AGE配体相互作用产生效应，导致许多慢性退化性疾病的发生[7]。

人类RAGE编码基因位于6号染色体上，包含11个外显子和10个较短的内含子[8]。RAGE是一类模式识别受体，正常情况下RAGE表达量很低，当机体出现AGE聚集，RAGE表达量上调，激活如磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases，MAPK）、应激活化蛋白激酶（Stress-activated protein kinase，SAPK）、信号传导及转录激活因子（Signal transducers and activators of transcription，STAT）等多种信号传导通路的级联放大反应，激活下游核转录因子（NK-κB）等，调节多种基因的转录表达，炎症因子释放，导致血管通透性增高，单核细胞黏附，基质成分增多等病理变化，在动脉粥样硬化损伤的发生发展中发挥作用[9]。研究认为，AGE与RAGE配体结合后，RAGE将信号传递至胞内，从而引发由氧自由基、蛋白酪氨酸激酶、蛋白激酶C、细胞外信号调节激酶、p38丝裂原蛋白激酶和NF-KB等构成的信号转导途径[10]。虽然AGE与RAGE配体结合后RAGE首先与哪种蛋白结合，目前还不完全清楚，但对RAGE多聚核糖体mRNA研究发现，RAGE有3种主要的剪接变异体，分别为全长膜结合型、截去C端可溶型（sRAGE）和截去N端膜结合型。全长膜结合型有完整的胞外段、膜镶嵌区和胞内段;sRAGE为RAGE的胞外段部分，缺少跨膜镶嵌区和胞内段;膜结合型仅有膜镶嵌区和胞内段，无胞外段部分[11]。因此只有全长膜结合型和sRAGE能与配体结合，膜结合型由于缺失胞外段不能与配体结合。而sRAGE缺少跨膜镶嵌区和胞内段，其与AGE配体结合后，信号不能传递至胞内，不会发生信号传导通路的级联放大反应，同时sRAGE可与全长膜结合型竞争结合其配体，对机体的多种病理状态起到保护作用[12]。降低AGE，阻断RAGE表达量上调，刺激机体产生更多的sRAGE等，被认为是缓解氧化应激，预防动脉粥样硬化及其并发症的方向标[13]。

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）产生过多，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤，在动脉粥样硬化损伤的发生发展中发生作用。SOD是机体内清除氧自由基的抗氧化酶，其功能是清除氧自由基保护细胞。CAT是一种酶类清除剂，可促使过氧化氢分解为氧和水，从而使细胞免于遭受过氧化氢的毒害。MDA是氧自由基攻击生物膜中不饱和脂肪酸而形成的氧化终产物，大量的MDA可导致蛋白质、核酸等大分子的交联聚合，对细胞有毒性作用[14]。

祖国医学认为风寒暑湿燥火等从经络传入脏腑，导致痰浊、血瘀、痰瘀交阻，是糖基化产物代谢紊乱慢性血管疾病的病机，是“痰浊”辨证的客观表现，早在东汉时期，张仲景在《金匮要略》中就描述石斛具有益气健脾、理气活血、补脾益阳等功效，是温阳健脾的重要代表方剂。现代药理学认为石斛多糖有抗炎、抗病毒、调节免疫功能、清除自由基等作用[15]。本研究结果显示，用石斛多糖干预SHR大鼠，可明显增高其SOD、CAT和sRAGE水平，降低其MDA、AGE及RAGE mRNA水平。提示石斛多糖可能通过降低AGE生成和积累，提高sRAGE表达，抑制RAGE活化，改善SHR大鼠体内氧化应激功能紊乱状态，在SHR大鼠的血管损害病理过程中起到保护作用。中医认为动脉粥样硬化性疾病本为阴阳失调，标为内生之风、痰浊和瘀血。治疗上应当用活血化瘀，行气通络，豁痰利气等[16～21]。

本研究结果提示，石斛多糖可有效缓解SHR大鼠的氧化应激和晚期糖基化终产物及其受体功能紊乱状况。石斛多糖对SHR的症状有剂量效应关系，中等剂量可改善氧化应激症状，高剂量则改善晚期糖基化终产物及其受体症状，为治疗血管重塑提供新型的空间。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-05-23 修回日期：2019-07-12）

（編辑：潘明志）