铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制研究*

徐雁峰,王慧敏，张 冬

(1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014000；2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院呼吸科)

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是目前临床上常见的革兰阴性杆菌，是最常见的引起严重院内获得性感染的条件致病菌之一。在机体抵抗力下降或免疫功能受损或是侵入性操作时(如留置尿管、呼吸机辅助通气)易引起各种感染，如泌尿系感染、呼吸道感染、脑膜炎、烧伤感染等，其中以下呼吸道感染最为常见，包括支气管扩张合并感染、慢性阻塞性肺疾病合并感染、呼吸机相关性肺炎等，且主要分布于重症监护病房。铜绿假单胞菌具有易定值，易变异，易耐药特点[1]。该菌可随着医护人员的手接触、医疗用水、机械通气等直接或间接性传播；在国外，慢性铜绿假单胞菌的定植是囊性纤维化(CF)肺病过程中的核心因素，是导致CF患者发病率和死亡率上升的主要原因。Zavascki等[2]进行的研究表明，抗生素的选择压力和长时间使用加快了细菌突变的速度。因此抗生素的滥用，使得铜绿假单胞菌基因发生突变，导致耐药性在细菌间进行水平转移，使得铜绿假单胞菌耐药现象逐渐突显，出现多重耐药铜绿假单胞菌(Multidrug-resistant pseudomonas aeruginosa，MDRPA)，给人们的安全带来巨大的威胁，引起了感染相关专家对公共卫生的关注。由其所引起的疾病具有难治愈、高致死率及迁延不愈性等特点，给临床治疗带来巨大困难，严重威胁人类的健康。

碳青霉烯类抗生素(Carbapenem antibiotic)是抗菌谱最广、抗菌活性最强的一类β-内酰胺类抗生素，曾一度是治疗铜绿假单胞菌感染的首选药物。20世纪70年代末期，默克公司研究人员从牲畜链霉菌中发现一类新的β-内酰胺类抗生素-硫霉素，这是历史上第一个碳青霉烯类抗生素。1987年，该公司通过对硫霉素的半合成结构修饰，成功开发出第一个用于临床的碳青霉烯类抗生素-亚胺培南，之后碳青霉烯类药物开始被陆续开发并广泛应用于临床各科室，目前以亚胺培南和美罗培南为代表的碳青霉烯类抗生素被临床广泛用于治疗铜绿假单胞菌感染，尤其在重症感染患者治疗上发挥了重要作用。然而近年来，世界各地逐渐出现了耐碳青霉烯类抗生素铜绿假单胞菌(Carbapenem-resistant pseudomonas aeruginosa，CRPA)，2017年世界卫生组织(WHO)制定了一份关于全球耐药菌的排列名单，耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌与耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌，耐碳青霉烯类、第三代头孢菌素的肠杆菌科细菌排在最前。耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的出现使得临床上对感染性疾病的治疗变得愈加困难。Hong等[3]通过对50个国家临床CRPA分离株的耐药情况进行分析，发现在巴西、秘鲁、哥斯达黎加、俄罗斯、希腊、波兰、伊朗和沙特阿拉伯等地铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药率均高于50 %。美国INFORM(International network for optimal resistance monitoring)监测了2012～2015年79个美国医疗中心铜绿假单胞菌对美罗培南的耐药率，结果显示耐药率从18.0 %上升到19.1 %[4]。2015年、2016年、2017年中国细菌耐药性监测CHINET结果显示,PA对亚胺培南的耐药率为27.6 %、28.7 %、23.6 %，对美罗培南耐药率为23.4 %、25.3 %、20.9 %。一项对全球CRPA的流行病学报道显示，南美洲、欧州和西南亚地区是CRPA的主要地区，对碳青霉烯类抗生素的耐药率最高可达75.3 %。可见铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素具有很高的耐药性。

CRPA的出现，给临床抗感染带来了严峻的考验，因此研究铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制具有重要意义，本文就其耐药机制做一综述。

1 产生碳青霉烯酶

铜绿假单胞菌可产生β-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶等多种酶，其中产β-内酰胺酶是PA耐药的主要机制，此酶可以通过水解或非水解方式破坏β-内酰胺酶的β-内酰胺环使抗菌药物失活而无法发挥抗菌作用。目前对于β-内酰胺酶的分类法主要有两类，Ambler分子结构法是1980年Ambler提出的，根据β-内酰胺酶氨基酸序列分为A-D类，其中A类、C类和D类β-内酰胺酶是依赖丝氨酸发挥作用，而B类β内酰胺酶是依赖金属离子发挥作用，是引起铜绿假单胞菌获得性耐药的主要酶。另一种分类方法是Bush分类法，是Bush于1995年提出，他以酶作用的底物、抑制剂谱的不同将β-内酰胺酶分为四个大类(1-4)及六个亚类(a-f)，主要包括超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、金属酶(MBLs)、头孢菌素酶(AmpC)，OXA型内酰胺酶等。碳青霉烯酶是一类能水解碳青霉烯类抗生素的β内酰胺酶，主要是指Ambler法的A、B、D类。

1.1A类碳青霉烯酶 A类碳青霉烯酶包括KPC型、GES型、SME型、IMI型、SFC型等，其中以KPC型和GES型最为常见，以质粒形式存在，造成大范围耐药铜绿假单胞菌的传播。近年来对KPC型碳青霉烯酶报道较多，KPC多见于肺炎克雷伯杆菌，1996年首次在美国的一种肺炎克雷伯菌中检测到。2006年，哥伦比亚国际医学研究和教育中心首次报道KPC-2在假单胞菌中的存在情况，2011年浙江大学医学院附属第一医院报道了首例产blaKPC-2型碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌，之后KPC在铜绿假单胞菌的报道逐渐增多[5]。KPC酶属于Ambler-A类，Bush-2f类，位于质粒或染色体上，染色体编码的KPC可能有利于产KPC铜绿假单胞菌高风险克隆的扩散。Garcia等[6]通过比较产生KPC酶的肺炎克雷伯菌感染爆发之前和之后铜绿假单胞菌分离株的耐药性，发现爆发后铜绿假单胞菌获得了KPC基因，从而表明了KPC基因可在细菌间传播导致铜绿假单胞菌获得对碳青霉烯类抗生素高水平的耐药性。目前已经鉴定出至少23种KPC蛋白变体。

1.2产金属β-内酰胺酶(metal-β-actamases，MBLs) 金属β-内酰胺酶(metal-β-actamases，MBLs)是以金属离子为活性中心的酶，可以水解大部分β-内酰胺类抗生素，且需要依赖金属离子Zn2+发挥作用。首次发现是因蜡样芽胞杆菌产生能被EDTA抑制的β-内酰胺酶，之后世界各地相继报道了能产生MBLs的各种细菌。编码MBLs的基因位点存在于铜绿假单胞菌的质粒、转座子或染色体上，以基因盒存在于整合子之中,大部分位于Ⅰ类整合子,通过整合子传递作用,使耐药性在革兰阴性细菌间水平传播扩散，引起铜绿假单胞菌的多重耐药(MDR)甚至泛耐药(XDR)，进而导致感染的爆发，使得临床治疗变得复杂化。MBLs可分为天然和获得性金属酶，获得性MBLs主要为质粒介导的，随着质粒的移动将耐药基因播散在各个菌株，是临床上最多见的。天然MBLs为染色体编码的，存在于一些临床非重要致病菌中，不具有传导性，没有致病性，是细菌为适应生存环境而产生的酶。获得性MBLs是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生获得性耐药的主要原因。脉冲场凝胶电泳实验(PFGE)发现，产MBLs铜绿假单胞菌在遗传学上紧密相关，表明MBLs基因的扩散是由耐药菌株的克隆传播或耐药基因在不同菌株间传递引起的[7]。MBLs属于Ambler-B类，Bush-3类，目前发现的获得性金属酶包括IMP、VIM、GIM、SPM、SIM、NDM-1、FIM-1，临床最常见的是IMP和VIM。近年来发现了MBLs的亚类，进一步说明了MBLs的持续多样化以及这些酶在革兰氏阴性菌种中的持续全球传播。

IMP-1是1991年日本研究者在粘质沙雷菌体内发现了第一个获得MBLs，之后不断发现新的获得MBLs，这些金属酶的宿主也从粘质沙雷菌扩大到了铜绿假单胞菌等肠杆菌科细菌，而铜绿假单胞菌是主要宿主。目前已发现了IMP五十几种亚型，分别由相应编码基因的不同位点发生突变产生。1999年意大利在铜绿假单胞菌中发现首个VIM-1型酶，随后在美国、法国、英国、意大利等国家相继发现铜绿假单胞菌产不同亚型 VIM基因。目前已发现了VIM四十几种，VIM-2是铜绿假单胞菌中分布最广的MBL，并且是多次爆发的来源。

NDM-1是一种新型金属酶，最初在2009年从一位感染肺炎克雷伯杆菌的瑞典患者分离发现，之后在铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌中均有发现。2011年，首次在塞尔维亚患者中记录了铜绿假单胞菌中NDM-1的存在,之后在世界各地耐药铜绿假单胞菌均有发现，NDM-1可以水解大部分β内酰胺类抗生素包括碳青霉烯类抗生素，是最广谱耐药的金属酶。NDM-1位于质粒上，不仅可以在细菌间转移，而且能使所在宿主菌成为超级细菌，严重威胁着人类健康。FIM-1是2012年从佛罗伦萨血管移植物感染患者培养的多重耐药铜绿假单胞菌中分离出一种新型金属酶，位于染色体上，与NDM表现出最高的相似性(约40 %氨基酸同一性)，FIM-1具有广泛的底物特异性，优选青霉素和碳青霉烯类[8]。

KHM-1是1997年在日本的多重耐药柠檬酸杆菌分离物中鉴定出来的，之后再未报道过。Pfennigwerth等[9]在铜绿假单胞菌分离物发现了新的金属酶HMB-1，与KHM-1在核苷酸水平上的同一性为73.6 %，在氨基酸水平上的同一性为74.3 %，但在碳青霉烯酶水解方面表现出明显差异，通过测定最低抑菌浓度(MIC)发现HMB-1对亚胺培南的水解高于KHM-1的2倍，而对美罗培南、厄他培南的水解效率非常相似。

1.3产OXA型酶 OXA型酶属于Ambler D类，Bush 2d类，因对苯唑西林或是氯唑西林等有很强的水解能力而得名。OXA型超广谱β-内酰胺酶，是从20世纪80年代后期随着DNA测序技术的发展才从丝氨酸β-内酰胺酶中分离出来，并单独成为一类。之后该酶在世界范围内陆续被检测到，如法国、西班牙、英国等许多国家均检出，近日秘鲁发现了同时表达OXA-1的铜绿假单胞菌[10]。国内在安徽、湖南、郑州、苏州、贵州等地也曾报道过OXA型酶。OXA型酶主要分布在鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌。Bert等[11]阐述了OXA型酶分5组，其中OXA-5、OXA-10、OXA-11、OXA-14、OXA-16、OXA-17、OXA-31等见于铜绿假单胞菌内[12]。OXA-198是2011年El等[13]新发现的D类β内酰胺酶，OXA-198基因位于IncP-11型质粒携带的Ⅰ类整合子上，易于在铜绿假单胞菌或大肠杆菌中转化。最近，Bonnin等[14]描述了产生OXA-198的铜绿假单胞菌与医院相关的丛集事件，揭示OXA-198的产生使碳青霉烯类药物敏感性降低。

2 膜通透性下降

细胞膜是药物进入细菌内发挥作用的第一道屏障，铜绿假单胞菌的细胞内膜由具有流动性的脂质双分子层组成，外膜包括脂蛋白、外膜蛋白和脂多糖等，脂多糖为6～7条链相互共价连接而成的脂肪酸链组成，这可降低外膜的流动性，阻碍脂溶性药物通过细菌外膜。碳青霉烯类抗生素进入体内发挥作用的靶位是位于内膜上的青霉素结合蛋白(PBPs)，需先通过外膜才能到达靶点，所以任何导致铜绿假单胞菌外膜通透性降低的因素都会导致抗菌药物无法到达作用位点，从而使细菌对该种抗生素耐药。

2.1膜孔蛋白的丢失 铜绿假单胞菌外膜上有许多微孔通道蛋白，如OprC、OprD2、OprE，其中外膜孔通道OprD2是以亚胺培南为代表的碳青霉烯类抗菌药物进入PA唯一通道。OprD2的基因突变或者缺失致使OprD2功能缺失或表达下调造成细胞外膜对抗菌药物通透性下降，是铜绿假单胞菌对亚胺培南等碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制。OprD2的缺失突变体现在编码区的一段片段缺失导致移码突变，形成新的密码子从而引起肽链异常，导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药。Liu等[15]通过对17株耐亚胺培南、美罗培南的铜绿假单胞菌分析显示其中14株OprD2蛋白的基因由于移码，无义突变或大缺失、或是缺少终止密码子而导致密码子编码提前终止，进一步表明OprD2的丢失使铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药性。因此认为Oprd2是造成PA对亚胺培南耐药的重要因素。OprD2的基因突变体现在OprD2结构基因、调控基因、调控因子等突变，进而影响OprD2蛋白水平或空间构象的改变。此外插入OprD2的序列(IS)元件也可导致OprD2基因失活，世界范围内均有报告不同的插入元件IS，南非(ISPa26)、克罗地亚(ISRP10)、伊朗(ISPa1328)、西班牙(ISPa133)、中国(ISPa1328、ISPre2)等。Shariati等[16]在OprD2蛋白基因中发现了一个新的插入序列ISPpu21与铜绿假单胞菌的碳青霉烯耐药性密切相关。

2.2主动外排系统过度表达 铜绿假单胞菌细胞膜上存在着将抗菌药物排出体外的外排泵系统。根据染色体的不同同源性，可将外排泵系统分为易化子超家族(MFS)、耐药结节化细胞分化家族(RND)、ATP结合盒超家族(ABC)、多重药物和毒性化合物外排家族(MATE)和小多重性耐药家族(SMR)五个超家族，其中RND外排家族与碳青霉烯抗菌药物的耐药有关也是最早发现的外排泵系统，主要分布在革兰阴性菌，参与多种抗菌药物的排出。1993年Poole等在铜绿假单胞菌中发现了第一个多药外排泵MexAB-OprM，之后陆续发现多个外排泵系统如：MexAB-oprM、MexXY-oprM、MexCD-oprJ、MexEF-OprN等。外排泵系统由膜融合蛋白如MexA、MexC，转运蛋白如MexB、MexD和外膜蛋白如OprD、OprJ三部分组成，三种蛋白协同作用将进入菌体内的碳青霉烯类药物排除体外，任一环节出现问题即可导致多重耐药甚至泛耐药。Babak等[17]研究显示62 %的个体外排泵MexAB-OprM基因过度表达，与先前报道的这些基因的过度表达超过50 %相符。MexXY-OprM系统和MexAB-OprM系统共用OprM作为其外膜通道蛋白，因此MexAB-OprM低表达也降低MexXY活性，此外MexCD-OprJ过表达可明显使MexAB-OprM产生不足。外排泵系统具有可诱导性，抗生素的不规范使用可诱导其表达增加，曾章悦等[18-19]通过体外碳青霉素诱导实验对敏感铜绿假单胞菌进行诱导，发现铜绿假单胞菌经其诱导后对美罗培南的最低抑菌浓度升高，考虑铜绿假单胞菌对美罗培南的耐药与外排泵表达量增加有关。

3 细菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)形成

1978年Costerton首先提出生物被膜这一概念，细菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)是指细菌附着于惰性物体或生物物体表面如医疗设备，留置导管或坏死的组织上，繁殖并分泌一些多糖基质和纤维蛋白等细胞外聚合物，将细菌粘连包裹其中而形成的膜样物。BF结构坚韧稳固，长期存在可作为细菌的保护伞使其逃避宿主免疫应答、抵挡抗菌药物的杀菌作用而难以根除，对抗生素产生耐药，进而导致难治性感染和慢性、持续性感染。铜绿假单胞菌生物被膜细胞外聚合物(EPS)可延缓包括抗生素的扩散，导致细菌对抗生素耐受。EPS是由胞外多糖、蛋白质、核酸组成，其中主要成分胞外多糖包括polysaccharide synthesis locus(Psl),pellicle Formation(Pel)和藻酸盐(Alginate)，尤其是Ps1对铜绿假单胞菌中BF形成具有重要作用。Psl多糖的过量产生导致铜绿假单胞菌的细胞表面和细胞间粘附增强，形成微菌落，稳固生物被膜结构的同时对抗生素产生耐药。研究发现形成生物被膜的多糖物质Psl可作为一种信号分子通过调节鸟苷酸的产生形成一种正反馈，进一步促进细菌产生细胞外基质形成生物被膜，这对于研究铜绿假单胞菌的耐药具有重要作用[20]。c-di-GMP信号通路被发现是导致生物膜形成的主要机制。藻酸盐(Alginate)是EPS主要成分，可以形成稳固的保护屏障阻碍抗生素穿透生物被膜，难以对包裹其中的细菌产生抗菌作用，导致感染反复发作。小RNA(sRNA)是铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要机制。Taylor等[21]描述了一个新的非编码小RNA(sRNA)转录物srbA对生物膜的形成和毒力有重要影响。

4 整合子(integron)的形成

整合子是存在于细菌质粒、染色体或转座子上的一种具有识别和捕获各种耐药基因并通过移动，将耐药基因传播在同种和不同种细菌间，最终导致临床上耐药现象的泛滥。整合子是Stokes和Hall于1989年首次提出的，由两端的保守区和中间的可变区构成,可变区中含有多种基因盒，大部分为耐药基因盒，在5′端保守段包含有编码整合酶的intI基因和负责基因转录的启动子，当整合子捕获到耐药基因盒后，在启动子的作用下发生转录从而使细菌获得耐药性。整合子根据其整合酶编码基因序列的不同可分为6类，其中Ⅰ类整合子最为常见且与铜绿假单胞菌耐药密切相关。目前在Ⅰ类整合子可变区中发现多种耐药基因盒，如VIM、IMP、SHV等，这些耐药基因使铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生高耐药水平。Khosravi等[22]通过研究发现铜绿假单胞菌耐药性与整合子密切相关，发现大多数(95.7 %)分离株包含Ⅰ类整合子且对美罗培南耐药性可达到(90.32 %)，对亚胺培南的耐药率达(83.87 %)。

总之，铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药现象是多种耐药机制协同作用的结果，并不单纯是由一种因素造成。CRPA的出现，给临床治疗造成了巨大的压力，这需要我们进一步深入研究其耐药及流行机制，为指导抗生素的合理使用及开发新的有效抗菌药物提供理论依据。近年来，多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)被广泛用于记录细菌基因的变异，进而实现耐药菌株的追踪,对研究铜绿假单胞菌的耐药机制具有重要意义。多位点序列分型是Maiden等人在1998年提出的用于分析基因的核苷酸序列，进而发现细菌基因的变异。MLST通过使用管家基因中的序列变异来定义类型，以ST编号为基本分析单位，每一个ST标号代表一种核苷酸序列信息，目前应用于耐药菌株的追踪。通过对铜绿假单胞菌的7个管家基因(acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE)进行PCR扩增纯化，产物测序后与BLAST对比得出七个管家基因等位基因谱编号，依据编号的组合即能够得到ST型，进而实现对全球铜绿假单胞菌的流行趋势及毒力进化变异的追踪调查。在铜绿假单胞菌中，MBLs的产生通常与序列类型(STs)111、175、357和235的多耐药高风险克隆相关，表明高风险克隆在成功传播临床重要抗药性决定因素中的重要作用。Papagiannitsis等[23]发现捷克医院中携带IMP-7的铜绿假单胞菌中ST357克隆编码整合子In-p110，证明大多数ST357分离株与IMP型MBLs的产生相关。Vanegas等[24]研究表明高抗生素选择压力有利于多克隆的出现，这些克隆能够分别含有KPC和VIM碳青霉烯酶，主要是ST235和ST111，但同时出现其他克隆如ST1755、ST463。序列类型235(ST235)是重要的铜绿假单胞菌克隆，铜绿假单胞菌ST235可以通过突变和获得当地耐药基因，对碳青霉烯类抗生素产生耐药性[25]。在ST235中已经描述了多种碳青霉烯酶，最常见的是VIM，其次是IMP，OXA，GES，KPC和NDM。目前发现质粒编码的产NDM-1的铜绿假单胞菌MLST分型有ST235，染色体编码的KPC基因可能有利于产生KPC的铜绿假单胞菌ST235扩增时的传播。Hu等[26]首次报道了产生KPC-2的ST463铜绿假单胞菌分离株的克隆，该克隆在浙江省快速出现和传播。