糖尿病患者红细胞内蛋白质糖基化修饰的研究进展*

李旭妍，孙明玥，杨丽丽，王亚奇，苏 燕

(内蒙古科技大学包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古 包头 014060)

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，主要由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。生物体内超过一半的蛋白质都会发生糖基化修饰。长期存在的高血糖会导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害和功能障碍，其机制可能与高血糖导致的蛋白质糖基化产物增多有关。红细胞存在于循环血液中，增高的血糖可以使红细胞表面及红细胞内的蛋白质进行糖基化修饰，从而影响红细胞功能，导致微循环障碍，可能成为引起糖尿病微血管并发症的重要机制之一。因此，进一步明确红细胞内蛋白质糖基化与糖尿病发生发展的相关性对于糖尿病的诊断、治疗和预防具有重要意义。

1 高血糖与蛋白质糖基化反应及其位点的关系

蛋白质糖基化是蛋白质的氨基酸残基与糖链形成糖苷键的过程。该反应又称为美拉德反应，最早是法国食品化学家Maillard在一次不成功的合成多肽的实验中偶然发现的，直到1980年才发现它参与多种疾病的病理变化，因此成为医学研究领域的热点。人体内蛋白质糖基化反应主要有两类：一类是发生在细胞内质网上，经酶催化生成糖蛋白的反应；另一类是没有酶参与的非酶糖基化反应，主要发生在细胞外环境，包括膜蛋白、分泌蛋白及体液中的蛋白等。在高糖条件下，体内的酶促和非酶促反应均可以发生，高浓度葡萄糖能充分与蛋白质的N-末端和赖氨酸侧链氨基接触生成Schiff碱(醛亚胺)，再经过催化重排形成更稳定的早期糖基化产物，即Amadori产物(酮胺或果糖胺)[1]。Amadori产物经过一系列复杂的反应生成晚期糖基化终产物(AGEs)，糖基化终产物的形成和堆积将加速机体糖尿病的病变程度和进展速度，是肾病、视网膜病变和动脉粥样硬化等并发症的主要致病因素。与非酶糖基化不同，在高糖条件下，酶促糖基化反应则是由于催化糖基化反应的糖基转移酶的表达发生了改变，因此影响蛋白质糖基化的进程。而蛋白质糖基化时，糖链会与蛋白质的不同氨基酸残基连接产生不同的糖基化产物，与糖链连接的位点就是糖基化位点。Martyna[2]等人在探索鉴别赖氨酸衍生物糖基化的方法时，通过检测体内外α-晶状体蛋白赖氨酸分布来鉴别糖基化的位点，发现体外不同浓度高糖(蛋白质与糖的摩尔比分别为1∶1 000,1∶500,1∶370)处理后的α-晶状体蛋白有许多反应位点，但赖氨酸是最易发生糖基化的。同样Barnaby[3]等人和Silva[4]等人的实验也证明了这一点。蛋白糖基化修饰位点的检测方法包括：基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、液相色谱-质谱( Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer，LC-MS)、同位素标记法、核磁共振谱( Nuclear Magnetic Resonance Imaging，NMR)。这些方法各有优劣，必要时可以联合使用。

2 糖尿病患者红细胞内蛋白质糖基化的研究

糖基化对蛋白质的构象、运输、定位有着重要的作用，并参与分子识别、信号通路传递等重要过程。N-端糖基化是较为普遍的糖基化，主要发生在细胞外环境的蛋白质中，包括膜蛋白、分泌蛋白、体液中蛋白，而这些蛋白一般是疾病诊断和治疗的对象，因此人们对这些蛋白质研究的频率较高。红细胞随血液不断循环于全身，是最早感知血糖浓度变化的细胞之一。因此，研究高血糖对红细胞内蛋白的糖基化修饰及其功能的改变对糖尿病的诊断和预后判断具有重要意义。

2.1血红蛋白 血红蛋白(Hemoglobin，Hb)是红细胞内的携氧蛋白，也是含量最多的蛋白。体内发生非酶糖基化的各种蛋白质中，血红蛋白的研究最彻底、最透彻。高糖环境下，红细胞血红蛋白糖基化程度增加明显。Vevin[5]等将红细胞置于37 ℃的葡萄糖溶液(终浓度分别为10 mM、15 mM、20 mM)中孵育30 min后，浓度为20 mM葡萄糖孵育的红细胞发生血红蛋白糖基化量增加。又有研究表明[6]，果糖比葡萄糖更易与血红蛋白发生糖基化反应。血红蛋白与果糖的氨基形成Schiff碱的速率比与葡萄糖高7.5倍，进一步印证了果糖能加速血红蛋白糖基化。血红蛋白糖基化是通过两步连续的非酶促反应完成的。首先，Hb N末端残基或Lys残基侧链的中性氨基与糖分子中的醛或酮基相互作用，形成可逆的Schiff碱中间体。该中间体经历不可逆的分子间Amadori重排以产生更稳定的酮胺结构[7]。糖尿病患者血糖浓度增高引起的血红蛋白糖基化最丰富的产物是HbA1c，它在红细胞里120 d的生命周期中不断地累积，能够较好反映患者检测前2～3个月的血糖水平，因此成为糖尿病和糖尿病筛查的诊断标准。

2.2酶蛋白 成熟红细胞除细胞膜和胞质外，不具备其他细胞器(如线粒体)。因此成熟红细胞利用葡萄糖供能、输送O2、维持细胞形态的代谢途径主要有3条：糖酵解途径、2、3-二磷酸甘油酸旁路、磷酸戊糖途径。己糖激酶、丙酮酸激酶、6-磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等是这三条途径的关键酶。有研究显示[8]，长期的高血糖环境可能引起红细胞内代谢酶的活性发生改变，引起红细胞形态功能的改变进而成为糖尿病微血管病变的发病基础。

2.2.1葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase, G6PD)是一种普遍存在的酶，在所有细胞中都具有管家作用，对红细胞的完整性和功能影响尤为关键。作为磷酸戊糖途径的限速酶，G6PD可以催化葡萄糖分解产生NADPH和核糖-5-磷酸，NADPH为细胞的各种合成反应提供还原当量。目前发现，G6PD在癌细胞中发生O-端糖基化，从而使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的功能改变。Abraham[9]等研究结果表明，未使用C. planchonii水提物治疗的糖尿病大鼠红细胞中，G6PD的活性显著低于治疗组和正常对照。Elena Ganea[10]等的研究却发现G6PD在与20 mM果糖温育8 h后80 %的G6PD失活。因此，推测高糖对红细胞内G6PD活性可能具有抑制作用，甚至还会使其失活，但是否通过G6PD糖基化及其糖基化机制尚不明确。

2.2.2己糖激酶 己糖激酶(hexokinase, HK)是糖酵解途径中催化葡萄糖转化成葡萄糖-6-磷酸的酶，是糖酵解途径的限速酶。HK在哺乳动物体内中分为五种亚型：HK1、HK2、HK3、HK4、HK5，属于同工酶，它们分布于不同的组织中，但有着类似的结构和功能[11]。Mali[12]等通过研究糖尿病患者体内红细胞糖酵解酶活性时，发现糖尿病组红细胞己糖激酶活性高于正常人，但糖尿病组本身红细胞己糖激酶活性随血糖浓度升高活性反而降低。Brito[13]等同样发现在糖尿病大鼠红细胞中HK活性较对照组是增加的，而糖尿病大鼠肝脏和肾脏中HK活性较对照组低。这说明高血糖可以增加红细胞中HK活性，但对高血糖环境下的红细胞，不断升高血糖反而起到反作用，其是否与己糖激酶发生糖基化修饰有关，尚有待继续研究。

2.2.3乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH或LD)是糖酵解过程中催化乳酸和丙酮酸之间发生氧化还原反应的酶，它存在于机体的所有组织细胞中，以心和肾脏最为丰富。因为它常在组织损伤期间释放，所以它成为机体损伤或疾病(例如心力衰竭)的标志物。Mali[14]等在研究2型糖尿病患者红细胞乳酸脱氢酶动力学特性的改变时，发现糖尿病患者红细胞中乳酸脱氢酶的动力学性质有显著改变，这有利于丙酮酸有效转化为乳酸。说明糖尿病患者红细胞中乳酸脱氢酶活性升高，促进乳酸生成。非酶促糖基化是糖尿病的显著特征，但不清楚这种结构变化是否会影响LDH的催化活性，或影响糖尿病RBC中LDH同工酶结构发生变化，需要直接的实验来确定这些可能性。

2.3膜蛋白 红细胞膜是主要由脂质、蛋白质和糖类组成。膜蛋白主要有血影蛋白、肌动蛋白、锚蛋白和带4.1蛋白等，它们相互结合、缠绕，构成蛋白骨架，以维持细胞形态和变形性。还有一部分蛋白镶嵌在细胞膜上充当载体或离子交换器，如ATP酶、缬氨酶素。

2.3.1ATP酶 ATP酶又称为三磷酸腺苷酶，普遍存在于各种活细胞细胞膜上，通过水解ATP为跨细胞膜物质运输提供能量。红细胞膜表面的ATP酶有Na+-K+ATP酶、Mg2+ATP酶、Ca2+ATP酶等。Na+-K+ATP酶在红细胞膜上维持钠和钾梯度，Ca2+ATP酶则是维持红细胞内Ca2+的稳定。有证据表明非酶促糖化导致ATP酶功能受损，如Na+-K+ATP酶和Ca2+ATP酶[15]。据报道[16]，高浓度葡萄糖孵育对红细胞膜上的Na+-K+ATP酶有抑制作用。同样，Menon[17]等也发现，糖尿病大鼠模型的红细胞膜上的Na+-K+泵、Mg2+泵活性低于正常组，而Ca2+泵活性与正常组持平，说明高血糖环境会抑制细胞膜上的部分质子泵的活性，影响细胞稳态，造成疾病的发生，但具体是否是糖基化修饰影响质子泵活性还需实验验证。

2.3.2肌动蛋白 肌动蛋白(actin)是一种高度保守的球状多功能蛋白质，可在细胞质中形成微丝。它是所有真核细胞中含量最丰富的蛋白质之一，有α、β和γ三种。α肌动蛋白是肌肉组织中的收缩装置的主要成分；β和γ肌动蛋白是细胞骨架的重要组成成分，参与细胞收缩机制，并充当细胞内介质的作用[18]。肌动蛋白对糖基化特别敏感，因为它具有缓慢进化的特性，并且含有几种易于被体外糖化剂修饰的赖氨酸和精氨酸残基。糖基化后的肌动蛋白的功能可能会发生较大改变，如细胞迁移、细胞内转运和转录调节[19]。但红细胞膜上的肌动蛋白糖基化修饰后是否会改变红细胞形态和功能的研究很少，还需继续关注。

2.3.3血影蛋白 血影蛋白(spectrin)是由α-β二聚体组成的大而灵活的蛋白质，它们头对头连接以形成规范的异四聚体血影蛋白结构。大多数仅存在于人红细胞膜上，与锚蛋白和肌动蛋白一样是细胞膜骨架重要组分。Resmi[20]的研究表明，红细胞膜上的血影蛋白可以发生非酶糖基化。血影蛋白既发生O-端糖基化，又发生N-端糖基化。Samanta[21]等在内脏利什曼病中发现在α-血影蛋白上有四个潜在的N-糖基化位点，所有这些位点都含有共有序列Asn-Xaa-Ser / Thr。在Thr-817位置仅发现一个潜在的O-糖基化位点。然而，在β-血影蛋白中，发现了两个潜在的N-糖基化位点，没有潜在的O-糖基化位点。Mahindrakar[22]等的研究发现2型糖尿病患者血浆中，血影蛋白糖基化增加，几乎是血红蛋白糖基化的3倍。红细胞膜血影蛋白糖基化状态的改变可能影响2型糖尿病红细胞的完整性、寿命、变形性和粘弹性。然而，需要进一步阐明其潜在的生化机制。

2.3.4带3蛋白 带3蛋白又被称为人类红细胞阴离子转运蛋白1(anion exchanger1, AE1)，它是存在于红细胞膜上的一种内在蛋白质，占红细胞膜蛋白质总量的25 %。它属于跨膜蛋白，在质膜上介导氯离子(Cl-)与碳酸氢盐(HCO3-)的交换，在完成组织CO2运输、肺CO2排出过程中发挥重要作用。Reithmeier[23]等在人类红细胞膜上的带3蛋白的阴离子交换作用的研究中发现带3蛋白中单个N-糖基化位点Asn642，该位点位于长多肽区段(Gln625-Pro660)中间的一个区域。带3蛋白虽然可以发生糖基化，但糖尿病患者红细胞膜上的带3蛋白是否发生糖基化反应还未有实验证实，有待继续探索。

3 展望

红细胞内充斥着不同的蛋白质，它们承担着各种各样的功能，如催化能量代谢反应的多种酶、构成红细胞膜的膜蛋白等。当机体处于高糖状态下，红细胞内的蛋白质会与糖发生糖基化反应，并进一步导致红细胞的能量代谢、形态、功能等发生改变，加重糖尿病症状，引发一系列并发症。因此，从红细胞内蛋白质糖基化角度深入探究高糖对红细胞代谢及能量产生的影响，将为糖尿病及其并发症的预防、早期诊断和治疗等提供有力的新的思路。