CARDS TX致病机制的研究进展*

孙红匣，王冬梅，王海燕，曲艳杰

(1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014060；2.包头市第四医院儿科)

肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)是一种胞外非典型细菌，可引起各种呼吸系统疾病，包括咽炎，气管支气管炎等，是儿童社区获得性肺炎(community acquired pneumoniae，CAP)的常见病原体。近年来，肺炎支原体感染率逐年上升，重症与难治性肺炎支原体肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumoniae，MPP)比例也增高。社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(community-acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS TX)是MP表达的一种新型毒力蛋白，具有ADP-核糖基化和空泡化作用，在MP致病机制中发挥着主要作用。许多研究表明仅CARDS TX本身就可重现或模拟与MP感染引起相关疾病发生的炎症反应和病理学改变，此外，相关研究显示CARDS TX的量和作用时间与MP感染相关疾病严重程度成正相关，但目前仍缺乏高效、特异的CARDS TX的早期及定量检测手段。目前，国外许多研究逐渐明确了CARDS TX的分子结构、分子致病机制、生物学特性，文章将从CARDS TX的发现、致病机制、结构功能关系以及在哮喘和其他MP感染相关疾病等方面进行系统综述。

1 CARDS TX的发现

早在2006年，Kannan等[1]就发现了MP表达的一种毒力因子(MPN372)，后被命名为CARDS TX。CARDS TX大小为68-kDa，由591个氨基酸组成，与百日咳毒素(pertussis toxin ,PTX/PT)S1亚基(PTX-S1)具有同源性。它有多个高免疫原性的抗原表位，可引起强烈的血清转化。Kannan等[1]发现CARDS TX分布于MP的整个表面，包括尖端细胞器，这种模式与粘附素蛋白P1相似，而且CARDS TX的表达受转录和翻译的环境信号的影响，在MP感染过程中表达明显上调[2]，CARDS TX只有与宿主细胞结合、内化后才会发挥细胞毒性作用，并且这种毒素作用具有时间和剂量依赖性，此外，相关数据也显示CARDS TX转录物和蛋白在MP感染时选择性早期合成。Ramasamy等[3]发现CARDS TX的细胞内分布具有温度和时间依赖性，与内质网高尔基中间隔室(ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC)围绕核周区域共定位[3]。

2 CARDS TX的致病机制

2.1结合 CARDS TX与宿主细胞结合后才会内化进入宿主细胞。研究显示宿主气道上皮细胞表面由表面活性物质覆盖，约5 %为表面活性蛋白(surfactant protein，SP )，而AnxA2(annexinA 2，AnxA2)是膜联蛋白家族成员中的一种蛋白，大小为36 kDa，在细胞表面和胞内均表达[3]。研究显示CARDS TX能与SP-A(surfactant protein A，SP-A )和AnxA2结合，而且基于SP-A比AnxA2的表达更占优势，SP-A更优于作为结合靶标[4-5]。CARDS TX与AnxA2的结合具有特异性和浓度依赖性，研究发现CARDS TX内化之前与AnxA2共定位，并由CARDS TX的C端介导，敲低或增加AnxA2的表达均会影响CARDS TX的结合、内化以及随后的空泡化作用，此外，AnxA2还可作为CARDS TX的功能受体参与细胞内运输[4]。研究显示当减少或消除AnxA2表达时，仍可检测到毒素的结合和内化能力，推测可能存在细胞亚群不能有效沉默AnxA2或少量的AnxA2足以促进CARDS TX结合与内化或胞内AnxA2蛋白相对稳定或其他受体分子继续促进CARDS TX结合和内化[4]。随后研究发现CARDS TX特异性结合磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)和鞘磷脂(sphingomyelin ，SM)，PC和SM都含有磷酸胆碱头部基团，SP-A与DPPC直接相关[5-6]。研究证实A型肉毒杆菌神经毒素的共同受体是由蛋白质和膜脂质成分构成，虽然CARDS TX特异性结合的主要结构成分是PC和SM，但二者能否作为CARDS的共同受体仍有待研究[6]。

2.2内化 大多数细菌毒素相关的摄取机制始于网格蛋白包被的小窝或不依赖网格蛋白的内吞途径[7-8]，如假单胞菌外毒素A 和志贺毒素,炭疽毒素通过网格蛋白包被的囊泡和网格蛋白独立途径被内吞，霍乱毒素主要由胞腔内膜依赖性机制内吞[8]，而白喉毒素仅限于网格蛋白依赖性内吞。研究发现重组CARDS TX(recombinant CARDS toxin，rCARDS TX)的内化与网格蛋白介导的内吞机制有关，CARDS TX与宿主表面受体结合后，由网格蛋白介导内化[8]，AnxA2作为功能性受体也参与了CARDS TX的内化以及随后的ADP-核糖基化和空泡化，这与AnxA2协助clathrin-和caveola介导的内化并参与巨细胞性细胞吞噬相似[4,8]。

2.3细胞内运输 细菌毒素利用多种途径来达到它们的胞内靶点。一些毒素，如白喉毒素(diphtheria toxin ，DT)和肉毒杆菌毒素，在细胞水平以pH依赖性方式跨膜转运穿过胞质溶胶[3]。其他细菌毒素如志贺毒素(shiga toxin ，ST)，霍乱毒素(cholera toxin，CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin，LT)，利用逆行转运途径到达内质网( endoplasmic reticulum，ER )[3,8-11]。最近Ramasamy等[3]发现CARDS TX易位通过早期和晚期内涵体(endosomes)和高尔基复合体，并集中在核周区利用其独特的KELED序列逆行转运至ER以实现其细胞毒性能力。KELED序列与他细菌毒素C末端的KDEL序列具有相似作用，介导毒素逆行转运至ER，不同的是，KELED序列位于D1和D2(tandem C-terminal β-trefoil subdomains ，D2 + D3)，结构域之间，其氨基酸为268-272。为了确定KELED序列介导毒素向ER逆向转运，Ramasamy等[3]定点诱变将编码谷氨酸的269,271位或两者的核苷酸改变为编码丙氨酸的核苷酸，产生三种CARDS TX构建体即KALED(K1)，KELAD(K2)和KALAD(K3)。研究显示CARDS TX与ERGIC共定位，KELED到K3的定点诱变，阻止了CARDS TX从高尔基复合体到ER的有效运输，导致了大量的K3毒素在高尔基复合体累积，与WT(wild-type，WT)CARDS TX的定位相反，而K3突变体不引起IL-1β分泌和空泡形成，但仍具有与WT CARDS TX相似的ADPRT活性，表明KELED相关氨基酸的变化不影响其它的ADPRT/ART活性以及CARDS TX向ER的运输在毒素介导的细胞毒性中起关键作用。此外，与K3相比，K1或K2构建体的ER定位和空泡形成与WT(野生型)相似，表明亮氨酸旁边至少需要一个带负电的氨基酸(即谷氨酸)将CARDS TX有效转移至ER[3]。使用ER-SNAP-trap方法进一步肯定了K3 突变体与calnexin(跨膜分子伴侣)非常有限的共定位是由于缺乏KELED序列[3]。虽然K3 向ER的转运明显减少，但并未完全阻断，表明这种逆向转运机制并不是唯一途径，这与Tang等在CT相关研究中观察到的结果相似。

2.4ART/ADPRT Kannan等发现CARDS TX的N-末端区域与许多ART毒素如PT、CT、DT、LT等的催化结构域共有有限的同一性。研究显示rCARDS TX相关ART活性具有巯基还原依赖性，与CT和PT相似，CARDS TX的ADP-核糖基化涉及通过ART活性将来自NAD+的ADP-核糖基基团转移至靶蛋白中的特定氨基酸。由于所有ADP-核糖基化毒素在没有其特异性受体的情况下也表现出NAD糖水解酶(NADase)活性，Kannan等[12]使用[羰基-14C] NAD进一步定义了具有完整NADase活性的最小CARDS毒素区。 与FL(全长)一样，CARDS TX的所有C-末端截短变体均显示出不同程度的NADase活性。大部分N-末端缺失产生不溶性蛋白质，通过有限的蛋白水解获取了可溶性的?38kDa和?33kDa产物，并对它们进行N-末端测序显示它们分别由残基264-591和308-591组成。 此外，Johnson等发现来自M. penetrans大小为78-kDa蛋白质即MYPE9110，也表现出ART活性，但MYPE9110和CARDS TX靶向结合不同的宿主蛋白质[3]。除了在 MP 的不同菌株中可以检出CARDS TX，支原体属中的其他微生物也发现了类似CARDS TX的ART。

2.5空泡化作用 早在2006年，Kannan等已经证明了rCARDS TX具有ART活性和空泡作用，结果显示这种微小空泡在核周区域开始形成，后逐渐增大融合最后导致细胞坏死，而且这种空泡作用具有剂量和时间依赖性。此外，研究发现CARDS TX的空泡化作用与RAS癌基因家族中Rab 9介导的细胞内吞作用相关[13]，rCARDS TX诱导的酸性空泡起源于内吞途径的Rab9相关区室，Rab9和液泡型ATP合成酶(vacuolartype ATPase，V-ATPase)均参与CARDS TX介导的液泡形成，V-ATPase与内吞体和溶酶体功能相似，使用 V-ATPase抑制剂巴弗洛霉素A1可阻断或减少空泡样改变，这表明rCARDS毒素介导的空泡形成依赖于V-ATPase酶[13]。CARDS TX的空泡特性与C末端结构域直接相关，而且N端截短都减少空泡形成，这表明N端区域在维持C端区域的构象完整性方面可能发挥作用[12]。

2.6过敏反应和炎症反应 MP不仅可以诱导炎症，也可以通过在甘油代谢过程中产生的CARDS TX、核酸酶和过氧化氢发挥细胞毒性[14]。研究发现仅rCARDS TX就可诱导各种炎性因子、趋化因子的释放，淋巴细胞(如CD4+T和CD19+B)、浆细胞的浸润、嗜酸性粒细胞的增多，黏液化生和AHR(airway hyperreactivity)等反应[6,15,31]。Maselli等[16]在灵长类动物中进一步证实了仅CARDS TX可导致MP感染类似的组织病理学改变，且CARDS TX在炎症反应中起主要作用。用rCARDS TX干预BALB/cJ小鼠和狒狒后，动物以剂量和活性依赖性方式增加促炎性细胞因子(IL-1α，1β，IL-6, IL-12, IL-17，TNF-α，IFN-γ)和几种生长因子和趋化因子(KC，IL-8，RANTES和G-CSF)的表达。CARDS TX具有高度免疫原性表位，能引起强烈的免疫原性反应，如惊人的IgM和IgG血清转换。相关研究显示CARDS TX作为一种可溶性的炎症触发因子，在 MP感染控制稳定一段时间后仍具有激发气道过敏性炎症的功能[1]。单剂rCARDS足以诱导混合嗜酸性粒细胞-淋巴细胞炎症、加重气道高反应性[2,15-17,31]，IL- 4、IL- 13、CCL17和CCL22的增加提示rCARDS TX暴露后募集Th-2细胞，rCARDS TX暴露导致AHR表征为增加气道阻力和肺部顺应性降低，肺功能障碍和炎症性病变依赖于CD4 +细胞[15,17,31]。CARDS TX通过其NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)组分的ADP核糖基化共定位并激活炎性小体，释放IL-1β[18]，ADP-核糖基化是一种独特的共价蛋白翻译后修饰，炎症小体激活和IL-1β释放需要CARDS TX的内化和ADPRT活性[18]，向ER有效运输CARDS TX也是诱导液泡形成和IL-1β释放的关键步骤[3], Segovia等也证实了NLRP3炎性小体是MP感染引起的炎症和免疫应答的关键调节剂[19]。CARDS TX干预小鼠可引起血清总IgE和CARDS TX特异性IgE的增加， Medina等[17]发现血清IgE的增加需要CARDS TX酶活性和STAT6，二者缺一不可。IgM和IgA的血清学应答可作为Mp感染的早期指标[20]，IgG抗体在感染发生后4-6周达到峰值，完整的特异性体液免疫对Mp的感染具有重要保护作用。有研究者报道，在急性感染和慢性感染定植状态下，Mp的IgG水平降低或不存在[21]。

3 结构与功能关系

最新研究显示CARDS TX具有独特的的KELED序列，高效介导CARDS TX向ER运输，CARDS TX向ER有效转运对诱导液泡形成和IL-1β分泌至关重要[3]。早在20世纪末，人们通过使用PCR介导的定点诱变以用UGG替换每个UGA密码子以表达全长编码序列长度rCARDS TX。目前已获取了MP不同临床分离株(S1、 M129， L2，J1和RJL1)CARDS TX的全长DNA序列，CARDS TX序列在MP各临床分离株中具有多态性。CARDS TX由17个α螺旋和43个β折叠组成，N-末端mART(mono-ADP ribosyltransferase，mART)结构域(N-terminal mART domain ,D1)和C-末端串联β-三叶草结构域构(D2 + D3)，这三个结构域构成一个三角形分子，结构域1(D1)容纳ADP-核糖基化活性，结构域2(D2)和3(D3)负责受体识别，结合，内化和空泡化[4,6,12]。串联的C端结构域D2 + D3空间结构与蓖麻蛋白B相似，不同的是，CARDS TX D2 + D3β-三叶草结构域不具有半乳糖结合位点[6]。D3的显著特征是其芳香族氨基酸含量，其中15个簇形与杜克嗜血菌(haemophilus ducreyi)的细胞致密扩张毒素(cytolethal distending toxin，CDT)中发现的芳香斑块相似， 可以介导CARDS TX进入宿主细胞[6]。CARDS TX介导的空泡化也存在于D2 + D3中，并且独立于D1或mART活性[12]。CARDS TX--炎性体相互作用的分子基础可能涉及CARDS TX ART和相邻的H4-S6-H5基序，后者介导D1-D3界面处的相互作用。也有研究表明PC，DPPC和SM结合活性位于D2 + D3，C-末端20残基的截短消除了CARDS TX与细胞表面的结合和随后的内化，表明受体结合功能位于D3中。CARDS TX结构和功能关系在细菌ADP-核糖基化毒素家族中具有独特性,PTX，CTx和热不稳定肠毒素的mART结构域与CARDS TX D1最密切相关,但是代替β-三叶形，它们具有与碳水化合物结合的多肽的五聚体。尽管CARDS TX，CDT和蓖麻毒素在结构上通常被认为相似，其中每个具有与两个β-三叶域结构配对的细胞毒性催化结构域，但从功能角度来看，CARDS TX相对于这些毒素仍然是独特的，因为蓖麻毒蛋白和CDT具有N - 葡糖苷水解酶和核酸酶催化活性[6]。

4 CARDS TX与MP相关疾病

研究发现MP持续存在与哮喘的急性发作和恶化、复发有关，为治疗增加难度[22,26]，最近的证据表明，可以通过大环内酯类药物抑制气道炎症以及根除肺炎支原体来改善哮喘控制[29]。但有研究表明MP的持续存在与哮喘的症状与长期控制没有显著相关[23,30]。之前研究显示单次暴露于CARDS TX足以诱导小鼠哮喘样疾病,并且加重AHR[15,17]。CARDS TX的粘膜暴露引起嗜酸性粒细胞增加、AHR增高相对应的升高的T辅助2型炎症反应、血清总IgE和CARDS TX特异性IgE的增加，特异性IgE识别CARDS TX N-末端的表位(N端1-249个氨基酸中)，但不与C端肽结合[1,15,17]，CCL-17和CCL-22的增加引起淋巴细胞和嗜酸性粒细胞募集并增加IL-4和IL-13的表达，嗜酸性粒细胞介导的肺部炎症和AHR增加在哮喘中发挥重要作用[24]。FL(全长)和N-末端肽可诱导肥大细胞致敏、脱颗粒[17]。有证据表明炎症小体和IL-1β在哮喘的疾病进展过程中发挥重要作用，哮喘患者血清或痰液标本IL-1β水平明显高于非哮喘患者或无症状哮喘患者，IL-1β的表达减少或IL-1β受体减少均会降低哮喘的气道过敏和支气管周围炎症[18]，而CARDS TX通过其NLRP3组分的ADP核糖基化共定位并激活炎性小体[18]释放IL-1β, 炎症小体激活也导致肺损伤和肺重塑，这与哮喘和慢性阻塞肺病的发病机制有关[25]，Maselli等[16]也进一步证实了CARDS TX与哮喘预后不良有关。

在儿科疾病中，MP除了与哮喘相关外，也是CAP的常见病原体，此外MP也与慢性肺病和肺外疾病有关[24]。据报道，MP约占所有下呼吸道感染的10-40 %[27]。有研究表明自身免疫可能是MP相关的迟发性脑炎以及急性横贯性脊髓炎，GBS(Guillain-Barré syndrome)，多发性神经根病和视神经炎的发病机制[2]。MP感染也与1 %～5 %的皮肤并发症如多形红斑和MP引起的皮疹和粘膜炎( Mycoplasmainduced rash and mucositis ，MIRM)表现为轻微红斑丘疹，水疱疹中毒性表皮坏死松解和极少史蒂文- 约翰逊(Stevens-Johnson)综合征[24,28]。MP感染的血液学表现包括由于自身免疫性冷凝集素引起的溶血性贫血和由于交叉反应性抗体使血浆血管性血友病因子裂解蛋白酶失活引起的血栓性血小板减少性紫癜，对于其他全身并发症，需要进一步研究阐明病理路径[24]，但是CARDS TX如何在这些疾病发挥作用尚未明确。

综上所述，CARDS TX在MP致病机制中发挥主要作用，它的分子结构、致病机制、生物学特性等方面逐渐明确，但CARDS TX的内化受体、细胞内转运机制可能存在其它途径，仍需进一步研究。CARDS TX许多气道反应性疾病和肺外并发症直接相关，但其分子致病机制尚未明确。CARDS TX与MP感染相关疾病严重程度成正相关，但目前仍无法进行CARDS TX的早期及定量检测，CARDS TX的早期定量检测有望为MP感染相关疾病的早期诊断、诊治、病情严重程度判断及预后等提供实验室依据，为临床工作提供新的思路。