OmpR对伤寒沙门菌巨噬细胞内生存能力的影响

魏丹丹， 谢中艺， 杨帆帆， 林立萍， 黄新祥， 张盈

(江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013)

伤寒沙门菌(Salmonellaentericaserovar Typhi，S. Typhi)属于肠杆菌科沙门菌属，人类是其唯一的感染宿主[1]。可经粪口途径传播感染人体引起消化系统感染，紧接着S. Typhi侵入肠壁淋巴组织并沿着淋巴管进入肠系膜淋巴组织，并被巨噬细胞吞噬，S. Typhi能够在巨噬细胞内存活和增殖，通过淋巴液及血液循环扩散到全身造成系统性感染[2]。

OmpR是双组分调节系统EnvZ/OmpR中的调节蛋白，磷酸化的OmpR参与许多信号传导[3]。研究表明，OmpR对酸应激、渗透压调节、上皮细胞侵袭能力等有重要意义[4]，并且也是细菌氧化应激调控网络的一部分[5]。EnvZ/OmpR双组分系统也可通过沙门氏菌致病岛2(SalmonellaPathogenicity Island-2，SPI-2)调控Ⅲ型分泌系统(T3SS)的表达，从而影响细菌的毒力[6]。本研究利用ompR基因缺陷株(ΔompR)及回补株(C-ΔompR)，探讨OmpR对S. Typhi巨噬细胞内生存能力的影响，并通过分析OmpR对细菌巨噬细胞内生存能力相关的SPI-2中3个操纵子首基因ssrA、ssrB和spiC的调控关系来研究其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒S. Typhi野生株GIFU10007(WT)由日本岐阜大学医学院微生物学教研室馈赠；S. Typhi空载体对照株(WT-pBAD33)，ompR缺陷带空质粒株(ΔompR-pBAD33)，ompR回补株(C-ΔompR)，ompR-pET28a-BL21重组蛋白表达菌由本实验室制备及保存；pBAD33质粒(氯霉素抗性)、pBAD33-ompR(ompR回补质粒)；pHRP309-ssrA、pHRP309-ssrB和pHRP309-spiC分别为ssrA、ssrB和spiC基因启动子序列与pHRP309中的lacZ基因相连。

1.1.2 主要试剂 巨噬细胞THP-1购自上海生科院细胞库；Trizol试剂为Invitrogen公司产品; 逆转录试剂盒、SYBR荧光定量试剂盒、快速DNA消化试剂盒均为TaKaRa公司产品；凝胶阻滞实验(EMSA)上样缓冲液为碧云天生物技术有限公司产品；β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒为Promega公司产品。

1.1.3 主要仪器 核酸紫外检测仪(德国Eppendorf公司)；凝胶成像系统(英国SynGene公司)；ABI2720型PCR仪，高速冷冻离心机以及CO2细胞培养箱均为美国Thermo公司产品；荧光定量PCR仪，电转化仪Gene Pulsero Ⅱ以及酶标仪均为美国Bio-Rad公司产品。

1.1.4 引物 基因特异性引物由苏州泓讯生物科技有限公司合成，序列见表1(下划线表示酶切位点)。

表1 特异性引物名称及相应序列

1.2 方法

1.2.1 细菌培养 将WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33以及C-ΔompR接种于液体LB培养基中，37℃，250 r/min培养过夜作为种子液。按1 ∶100将种子液转接至新鲜的LB培养液中培养至对数早期[D(600 nm)约为0.4]，加入0.2%(w/v)L-阿拉伯糖继续培养30 min以诱导ompR的表达。

1.2.2 THP-1胞内生存实验 THP-1细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、5% CO2培养箱静置培养。细胞培养板中每孔接种5×105细胞，加入150 ng/mL佛波乙酯诱导THP-1细胞分化48 h，诱导率约为70%。实验前1 h给细胞换上新鲜的RPMI 1640培养液。将WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33和C-ΔompR菌株按“1.2.1”所述培养诱导后，按MOI=10 ∶1加入THP-1细胞培养板中培养1 h。每孔加入100 μg/mL庆大霉素后继续培养1 h杀死胞外菌，弃上清液，PBS洗3次，将全部孔分为3等份。1/3孔内加入1 mL 0.5%(v/v)Triton X-100裂解细胞，适当稀释后涂在LB平板，37℃过夜培养后计数平板上的菌落并乘以稀释倍数记为T0；后2/3孔弃去1/2体积的培养液并加入等量新鲜培养液继续分别培养12 h和24 h，然后同样的方法计数菌落数记为T12和T24。计算并比较不同菌株的T12/T0和T24/T0(分别代表12 h和24 h细菌在巨噬细胞胞内存活能力)。实验进行3次生物学重复。

1.2.3 RNA提取和实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 将WT-pBAD33和ΔompR-pBAD33分别接种至液体LB培养基，培养至对数早期，离心收集菌体。Tri-zol法提取细菌总RNA，取1 μg总RNA，DNA消化试剂盒消化基因组DNA后利用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA。使用ssrA、ssrB和spiC特异性引物进行qRT-PCR，以16 S rRNA为内参基因，采用相对定量法分析各基因mRNA表达水平。每组设有平行样，实验重复3次。

1.2.4 β-半乳糖苷酶活性检测 以S. Typhi基因组DNA为模板，利用特异性引物(序列见表1)PCR扩增目的片段，与pHRP309质粒进行双酶切后酶连，将产物热击至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆提取质粒测序，序列比对完全正确后，将LacZ重组载体分别电转至WT和ΔompR感受态细胞中，PCR验证后，即菌株构建成功。将携带有LacZ重组质粒的WT和ΔompR培养至对数中期，离心弃上清, 预冷的 PBS洗涤2次后重悬。超声仪破菌，β-半乳糖苷酶活性检测酶联板孔中分别加入WT和ΔompR上清液，加入30 μL检测液后混匀，37℃静置至溶液完全变黄，记录反应时间，加入反应终止液混匀，利用酶标仪检测混合液的D(415 nm)值和D(595 nm)值。实验3次生物学重复。Miller Units的数值用来表示β-半乳糖苷酶活性，计算公式如下：Miller单位= 106×稀释倍数×[D(415 nm)-D(595 nm)]×1.75/[体积(μL)×作用时间(min)×D(600 nm)]。

1.2.5 OmpR蛋白的表达及纯化 接种ompR-pET28a-BL21重组蛋白表达菌至液体LB培养基中培养至对数期[D(600 nm)约为0.6]，加入1 mmol/L IPTG，30℃，100 r/min诱导6 h。收集菌体后超声波破碎，离心(13 400 r/min，4℃，30 min)，收集上清，用Ni柱纯化后转入透析袋中冰上透析，用PEG2000吸去透析袋中部分水分以浓缩蛋白，测浓度后使用SDS-PAGE分析其纯度，置于-80℃保存。

1.2.6 凝胶阻滞实验 以WT基因组DNA为模板，PCR特异性扩增ssrA、ssrB和spiC基因起始密码子上游约500 bp的启动子区域序列并纯化，16 S DNA作为阴性对照(引物见表1)。已纯化的His-OmpR蛋白溶液加入含20 mmol/L新鲜乙酰磷酸盐的结合缓冲液，室温孵育10 min使OmpR磷酸化，结合体系配制完成后，分别加入100 ng各基因启动子区DNA片段，30℃温育30 min后进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙啶染色后于凝胶成像仪显影且分析结果。

1.3 统计学分析

利用GraphPad Prism 6.0统计软件分析数据，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OmpR对伤寒沙门菌巨噬细胞内生存力的影响

为了研究OmpR对细菌巨噬细胞内生存力的影响，使用WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33和C-ΔompR菌株进行THP-1胞内生存力实验。结果显示，ΔompR-pBAD33在巨噬细胞内的生存力相较于WT-pBAD33显著降低，而C-ΔompR生存能力较ΔompR-pBAD33部分恢复(P<0.01，图1)，说明ompR的缺失可使S. Typhi在巨噬细胞内的生存能力下降。

a: P<0.05，b: P<0.01，与同时间点WT-pBAD33比较

2.2 OmpR对巨噬细胞内生存力相关基因转录水平的影响

选择与巨噬细胞内生存能力密切相关的SPI-2中3个操纵子的首基因ssrA、ssrB和spiC进行qRT-PCR分析，结果显示，ΔompR-pBAD33中ssrA、ssrB和spiC的mRNA水平较WT-pBAD33明显降低(P<0.01)。进一步利用β-半乳糖苷酶活性检测实验研究OmpR对ssrA、ssrB和spiC转录活性的影响，结果显示，ΔompR中ssrA、ssrB和spiC的β-半乳糖苷酶活性比WT明显降低(P<0.01)。见图2。以上结果表明，OmpR正向调控ssrA、ssrB和spiC的转录。

a:P<0.05，b:P<0.01，与WT-pBAD33比较

图2 qRT-PCR和β-半乳糖苷酶活性实验检测ssrA、ssrB和spiC的mRNA水平

2.3 OmpR蛋白的表达及纯化

为了获得OmpR蛋白，使用BL21表达菌株表达His-OmpR蛋白。如图3所示，经1 mmol/L IPTG诱导后，His-OmpR蛋白的表达量较未诱导明显增加，并且在上清液中有His-OmpR蛋白的存在，说明表达了可溶性的蛋白；经Ni柱纯化后，只有单一的目的条带，说明去除了其他非目的蛋白；进一步经浓缩后，使用相同体积的蛋白样进行SDS-PAGE，条带明显加深，说明蛋白浓度明显增加，达到了浓缩的目的。

M：蛋白分子量标准参照物

2.4 OmpR蛋白与巨噬细胞内生存力相关基因的相互作用

利用凝胶阻滞实验检测His-OmpR蛋白与ssrA、ssrB和spiC基因启动子区域的相互作用。如图4所示：His-OmpR与ssrA、ssrB和spiC的启动子区域均有结合，且两者的结合均呈现剂量依赖性。以上结果表明，OmpR蛋白能直接与ssrA、ssrB和spiC的启动子区域结合来调节这些基因的表达。

16S DNA：阴性对照，1～8泳道分别加入浓度依次递增的蛋白

图4ssrA、ssrB和spiC的凝胶阻滞实验

3 讨论

S. Typhi是常见的肠道致病菌，可感染人体消化系统进而侵入淋巴系统引起全身症状[7]。S. Typhi感染人体后能够逃避免疫系统的杀伤，在被巨噬细胞吞噬后仍然能够存活且具有复制能力[8]。

S. Typhi在吞噬细胞内的复制是由SPI-2控制，SPI-2编码的T3SS-2在巨噬细胞内起作用。T3SS可将效应蛋白穿过吞噬体膜输送至宿主细胞的胞质中，对细菌在真核细胞内的存活有着重要作用[9]。目前认为，参与SPI-2基因表达调控的双组分系统共有3套：EnvZ/OmpR、SsrA/SsrB和PhoP/PhoQ。SsrA/SsrB中的反应调节因子SsrB可激活SPI-2结构基因的表达[10]。SpiC蛋白(也称为SsaB蛋白)是由SPI-2编码的含127个氨基酸的蛋白质。SpiC蛋白作为T3SS2的效应蛋白，既可介导其他效应器的分泌，也能通过干扰宿主Hook3和(或)Tassc蛋白的活性，抑制含沙门氏菌的噬菌体与溶酶体和吞噬体的融合。spiC突变体无法在巨噬细胞内复制，并且对小鼠的毒力减弱[11]。OmpR调节蛋白在ssrA和ssaB的基因区域富集，说明OmpR与SPI-2之间有着复杂的联系[12]。本文选择SPI-2中3个操纵子的首基因ssrA、ssrB和spiC，通过qRT-PCR和β-半乳糖苷酶活性实验发现 OmpR可促进这些基因的转录。进一步的EMSA实验显示，磷酸化的OmpR可直接与ssrA、ssrB和spiC基因启动子区域结合。综上所述，OmpR能够直接调节巨噬细胞内生存力相关基因ssrA、ssrB和spiC的表达，从而增强S. Typhi在巨噬细胞内的生存能力。此研究为进一步探讨OmpR的功能及相关分子调控机制奠定了基础。