人胃内因子在谷氨酸棒杆菌中的表达及活性研究

董贵彬， 潘颖越， 司雅楠， 王新月， 白仲虎， 刘秀霞， 杨艳坤

(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室 工业生物技术教育部重点实验室 江南大学 生物工程学院， 无锡 214122)

人胃内因子(Gastric intrinsic factor，gif，GIF)是一种由胃黏膜壁细胞产生的糖蛋白(NCBI Reference Sequence: NP_005133.2；GeneID:2694)，具有结合并保证维生素B12有效吸收的功能。有人通过该作用机制提出了一种口服给药方式，可以保证药物不被降解且被人体有效吸收[1]。在人体内，GIF的缺乏将直接导致机体无法正常吸收维生素B12，进而引起机体患恶性贫血[2]。Mottram等人通过小鼠模型研究发现GIF缺失会导致机体免疫力下降，易感染肠道沙门氏菌等病菌[3]。GIF由胃黏膜壁细胞产生，存在于人的胃肠道内，与食物中的VB12结合后通过小肠吸收，在维持机体健康中扮演着重要角色，但是目前尚未有关于表达生产人胃内因子的研究报道。

此前，C.glutamicum主要应用于各种氨基酸和醇等小分子的生产[4-5]。研究发现，其在蛋白表达上同样具有优势。它不产内毒素，胞外水解酶活性低，能够产生正确折叠的外源蛋白[6]。目前已有用C.glutamicum表达scFv、EGFP、VHH和淀粉酶等外源蛋白报道[7-9]。C.glutamicum可以作为一种优良的宿主用于各种蛋白的发酵生产[10-11]，尤其是一些对内毒素等严格限制的药用蛋白。本研究拟利用谷氨酸棒杆菌CGMCC1.15647(C.glutamicumCGMCC1.15647)进行药用蛋白人胃内因子的表达生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

E.coliDH5α和C．glutamicumCGMCC1.15647由本实验室保藏。pXMJ19保藏于本实验室；pUC57-kan由苏州金唯智有限责任公司提供。

1.1.2 主要试剂与仪器

PrimeSTAR® Max DNA Polymerase，DNA Ligation Kit购自TAKARA公司；Hind III、BamH I购自Thermo公司；DNA凝胶回收、PCR纯化和质粒小量提取试剂盒均购自Axygen公司；人胃内因子(GIF)ELISA检测试剂盒购自ImmunoClone公司。

PCR仪购自LongGene公司；超声破碎仪购自sonics公司；AKTA蛋白纯化仪购自通用电气公司。

1.1.3 培养基

LB和LBB[LB添加1%(W/V)脑心浸出液]若用到固体，均补加1.8%(W/V)琼脂粉，若用到氯霉素或卡那霉素抗生素，针对E.coli和C.glutamicum的工作浓度分别为30和10 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 基因合成

从NCBI获取天然人胃内因子的氨基酸序列，对其编码序列进行密码子优化，由苏州金唯智有限公司进行序列合成，获取重组基因克隆载体pUC57-kan-rgif。

1.2.2 表达载体pXMJ19-rgif的构建

以pUC57-kan-rgif为模板，以rgif-F和rgif-R为引物，PCR克隆rgif。引物序列如下：

rgif-F:5′-TTCGAAGCTTAAAGGAGGACAACCATGGCCTGGTTTGCCCTG-3′(直线为Hind III位点，曲线为RBS)；

rgif-R:5′-CCGGGGATCCTTAATGATGATGATGAT GATGATACTGGGTGAAATTGGCG-3′(直线为BamH I位点，曲线为His标签)。

采用分子克隆技术将pXMJ19和rgif构建表达载体pXMJ19-rgif(图1)，经氯化铷法转化E.coliDH5α，筛选得到阳性克隆菌。

1.2.3C．glutamicum/pXMJ19-rgif的构建

采用文献所述转化方法[12]将构建好的质粒pXMJ19-rgif电击转化C．glutamicum获得表达菌株C．glutamicum/pXMJ19-rgif，并通过菌落PCR进行阳性克隆菌的验证。为了能够更好地反映GIF的表达情况，同时构建空质粒克隆C．glutamicum/pXMJ19做对照。

图1 rgif的基因合成和pXMJ19-rgif的构建

1.2.4C．glutamicum/pXMJ19-rgif和C．glutamicum/pXMJ19的诱导表达

C．glutamicum/pXMJ19-rgif和C．glutamicum/pXMJ19分别接种于5 mL氯霉素抗性的LBB，于30 ℃ 220 r/min培养过夜，之后转接到100 mL新鲜的氯霉素抗性LBB，培养10 h时分别添加100 μL浓度为100 mmol/L的IPTG，继续发酵18 h后收获菌体进行蛋白分析。

1.2.5C．glutamicum/pXMJ19-rgif的发酵条件优化

根据预实验以及查阅文献[13]，研究诱导剂浓度，诱导时机，发酵时长和发酵温度对C．glutamicum/pXMJ19-rgif发酵产GIF的影响。本优化采用正交试验设计，各因素的水平如表1所示，试验安排如表2所示。

1.2.6 WB结果灰度分析

使用Image J对GIF的WB结果进行灰度分析，间接对GIF进行定量。

1.2.7 GIF蛋白纯化及定量

表1 GIF发酵条件正交试验因素与因素水平

取20 mL发酵液，收集菌体沉淀，用10 mL镍柱纯化溶液A重悬菌体，并进行超声破碎，于12 000 r/min离心10 min收集上清，选用HisTrap FF进行目标蛋白纯化，用溶液B洗脱目标蛋白。按照文献[14]所述方法，进行蛋白定量。

1.2.8 GIF活性分析

取发酵表达GIF的菌体破碎液上清，用人胃内因子(GIF)ELISA检测试剂盒，严格按照说明书操作，进行GIF活性检测。

2 结果

2.1 pXMJ19-rgif的构建

rgif基因片段PCR克隆、pXMJ19空质粒酶切以及pXMJ19-rgif表达载体构建酶切验证结果如图2所示，rgif基因序列长度为1254 bp，与图示大小相符。得到的表达载体pXMJ19-rgif经酶切和测序验证无误。

1：PCR克隆rgif；2：pXMJ19空载体酶切；3：pXMJ19-rgif双酶切验证

1:rgifcloning by PCR; 2: enzyme digestion of empty pXMJ19 vector; 3: double enzyme digestion verification of pXMJ19-rgif

图2 表达载体pXMJ19-rgif的构建与验证

Figure 2 Construction and verification of the expression vector pXMJ19-rgif

2.2 表达菌株C．glutamicum/pXMJ19-rgif的构建

电转获取的表达菌株C．glutamicum/pXMJ19-rgif和C．glutamicum/pXMJ19经PCR验证均无误。

2.3 C．glutamicum/pXMJ19-rgif和C．glutamicum/pXMJ19的诱导表达

C．glutamicum/pXMJ19-rgif和C．glutamicum/pXMJ19在相同的条件下进行了发酵试验。GIF在C.glutamicum中的表达情况如图3所示。结果显示GIF可以在谷氨酸棒杆菌中大量表达，但是只有部分可溶。

2.4 正交试验优化C．glutamicum/pXMJ19-rgif发酵产GIF

使用ImageJ对正交试验收获菌体的WB结果进行灰度分析，比较各试验组WB条带的灰度值间接对比GIF的表达量差异，结果如表2所示。通过比较不同实验组条带的灰度值可知，在试验组9 A3B3C2D1的试验条件下，GIF的表达量最高。通过分析各因素的K值可知，GIF的产量在本次试验中，随着诱导剂浓度从50 μmol/L增加到100 μmol/L而增加，之后降低；随着诱导时间从0推迟到10 h持续增加；随着发酵时长从18 h增加到22 h而增加，之后降低，随着发酵温度从23 ℃增加到37 ℃持续降低。

A:WB 分析；B:SDS-PAGE分析；1：C．glutamicum/pXMJ19菌体可溶总蛋白；2：C．glutamicum/pXMJ19-rgif菌体可溶总蛋白；3：C．glutamicum/pXMJ19菌体破碎沉淀总蛋白；4：C．glutamicum/pXMJ19-rgif菌体破碎沉淀总蛋白

A: WB assay;B: SDS-PAGE assay;1: Soluble protein ofC.glutamicumBZH001/pXMJ19; 2:Soluble protein ofC.glutamicumBZH001/pXMJ19-rgif;3: Insoluble protein ofC.glutamicumBZH001/pXMJ19; 4: Insoluble protein of C.glutamicumBZH001/pXMJ19-rgif

图3 GIF在C．glutamicum中的表达

Figure 3 Expression of GIF inC.glutamicumBZH001

2.5 GIF发酵表达及纯化定量

以正交试验推测的最佳发酵条件，在转接后10 h添加终浓度100 μmol/L的诱导剂，在23 ℃条件下发酵22 h后收获菌体进行蛋白提取纯化，纯化结果如图4所示，成功获取GIF纯品。经计算，GIF的产量约为47.15 mg/L。

表2 GIF发酵条件正交试验优化实验组合表

1：总蛋白；2：流穿蛋白；3：洗脱蛋白

1: Total protein; 2: Loss protein; 3: Target protein

图4 GIF表达纯化

Figure 4 GIF purification

2.6 GIF活性分析

根据人胃内因子(GIF)ELISA检测试剂盒建立的方法绘制GIF标准品与VB12竞争抑制的标准曲线。随着GIF标准品浓度的增大，吸光度随之减弱。采用Logistic曲线拟合获得拟合方程为：y=1.04/[1+(x/320.67)^1.43]+0.02。发酵表达GIF菌体破碎液样品经测量产量为42.3 mg/L。

3 讨论

人胃内因子对于人体健康非常重要，它的缺失会导致恶型贫血的发生，同时可以降低人体免疫力。谷氨酸棒杆菌在蛋白的表达上具有巨大的潜力，尤其是其具有不产内毒素的特点，使该菌特别适合于药用蛋白的生产。

用原核生物表达人源蛋白目前还存在很大的限制。例如，大肠杆菌在发酵过程中会产生内毒素，原核生物普遍缺少蛋白修饰能力等，这对蛋白的表达和利用是很不利的。但是，谷氨酸棒杆菌作为一种食品级的微生物具有不产内毒素的优点。与真核细胞相比，原核生物还具有发酵周期短，培养成本低，便于基因操作，效益高等优点，有利于外源蛋白的发酵放大。

在可查阅的文献范围内，本研究是第一篇在C.glutamicum中表达GIF的研究，虽然存在部分不可溶蛋白，但通过正交试验对GIF发酵条件进行优化后得到极大的改善。除了发酵温度，同时优化诱导剂浓度、诱导时机和发酵时长。分析正交试验各因素R值可知，发酵温度、诱导时机、发酵时间和诱导剂浓度对GIF表达的影响依次减弱。交互作用分析正交试验诱导剂浓度和诱导时机时发现，诱导剂浓度发生变化时，GIF表达量随着诱导时机的变化也发生变化，两者存在交互作用。另外诱导剂浓度和发酵时长、诱导时机同发酵时长也同样表现出交互作用。目前得到最优发酵组合是：诱导剂浓度100 μmol/L，诱导时机10 h，发酵时长22 h，发酵温度23 ℃。该发酵条件下，GIF的产量经人胃内因子(GIF)ELISA检测试剂盒定量达到42.3 mg/L，与纯化定量存在差异，推测与谷氨酸棒杆菌缺乏糖基化修饰有关[15]。本研究是目前第一个在C.glutamicum中表达GIF的研究，为GIF的原核表达提供了一种可能的选择，并初步研究了GIF表达的主要限制因素。本研究发现优化发酵温度和诱导剂加入时机可以进一步有效提高GIF的可溶性表达，这可能是因为适当的低温和诱导时机的控制促进了GIF的正确折叠。为了更好地开发谷氨酸棒杆菌用于外源蛋白的表达，人为引入必要的蛋白修饰通路将是一个很有前景的研究方向。另外，对于修饰有严格要求的蛋白，在不考虑发酵成本的情况下也可以选择酵母、哺乳动物细胞等具有修饰能力的生物进行糖蛋白的表达。