白芷炮制前后红外光谱分析及欧前胡素的含量测定

刘丽军呼谧允马凤朵王金梅王培卿*

1.河南大学淮河医院,河南 开封 475000;2.开封市功效成分研究与保健食品重点实验室,河南 开封 475004;3.河南省药食两用资源功能研究国际联合实验室,开封,475004

白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formvsana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根。其味辛、性温,归胃、大肠、肺经,具有解表散寒,燥湿止痛,消肿排脓的功能。用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻渊、牙痛、带下、疮疡肿痛等症[1]。现代研究[2]表明,白芷主要含有香豆素、挥发油、苷类和微量元素等,具有解热、镇痛、解痉、降压、平喘、兴奋运动、呼吸中枢、抑制脂肪细胞合成、抗菌、光敏性等方面的药理作用[3]。白芷经醋炙之后可加强其消肿作用,并且醋具有通淋作用。金洁[4]等研究发现,历史上白芷的炮制品种大致有16种,主要分为净制、焙、煨、清炒、加辅料炒、浸、与药物同用等7个方面,但白芷炮制发展至今,只有生白芷被沿用,并且被各地方标准和药典收载。赵恒[5]考察了晒干、硫熏、80℃烘干、石灰埋藏等不同方法处理后白芷质量的比较;李卫敏[6]等采用HPLC法对经过规范化炮制和经过常规炮制后的白芷中欧前胡素含量进行测定;袁子民[7]等采取HPLC法建立生品和酒炖品的指纹图谱,比较炮制前后化学成分的变化。以上这些研究方法中,所采用的观察指标过于单一,容易因偶然因素造成结果的偏差。

现代红外光谱技术可以对复杂混合物体系进行整体性的分析和鉴定,以高信噪比的一维红外光谱为鉴定的基础,结合有较高分辨率的二阶导数谱,达到对复杂体系样本的分析与鉴定[8]。傅立叶红外光谱法是一种快速简便而非破坏性的分析方法,被广泛应用于中药品质的快速鉴别中[9]。近年来,红外二阶导数谱技术的扩展,使红外光谱图的分辨率提高,能获得更多的光谱信息,这将成为中药的分析鉴定的一种快速有效的新方法[10-11]。本文采用红外光谱法对白芷炮制前后的成分变化进行分析,找出生品及炮制品的红外谱图特征,并采用高效液相色谱法对白芷炮制前后欧前胡素的含量进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Affinity-1S傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津公司);电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器(北京有限公司));600Y型多功能粉碎机(铂欧五金厂);岛津高效液相色谱仪LC-20AT(DGU-20A5R在线脱气机、LC-20AT输液泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-M20A二极管阵列检测器);LC-Solution色谱数据处理系统(日本岛津公司);AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);KQ-500DB型数控超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

欧前胡素标准品(成都普菲德生物技术有限公司,140903);甲醇(天津市大茂化学试剂厂,色谱纯);乙腈(美国Fisher公司,色谱纯);溴化钾、其他试剂为分析纯;纯净水(杭州娃哈哈百利食品有限公司)。

白芷饮片于2016年9月购于河南禹州,经河南大学药学院中药教研室李昌勤教授鉴定为伞形科植物白芷A.dahurica的干燥根。

2 方法与结果

2.1 白芷的炮制

白芷:取白芷饮片,大小分档,除去杂质,备用。

醋白芷:取白芷生品,加一定量米醋拌匀,焖润,待醋被吸收尽后,置炒制容器内,用文火炒至规定的程度时,取出放凉。每100 kg白芷用米醋20 kg[12]。

2.2 样品制备

分别取白芷生品及醋炙品,干燥后打粉,过100目筛,60℃干燥至恒重,置干燥器中备用。

2.3 方法学考察

取白芷生品,粗制品各3 mg,精密称定,加溴化钾后,分别置于玛瑙研钵中研磨均匀,经压片机压制成厚度均匀的薄片。对压片进行扫描,获得各样品的一维红外光谱,并计算其二阶导数图谱。

扫描条件:光谱测定范围4 000～400 cm-1,扫描次数为20次,扫描时实时扣除水和二氧化碳的干扰。

2.3.1 精密度试验

将同一白芷生品压片连续扫描5次,将得到图谱进行相似度比较,见图1。相关系数分别为1.000 0、0.999 7、0.999 6、0.999 3、0.999 2,RSD=0.03%。结果表明,该仪器具有较好的精密度。

图1 白芷红外光谱精密度对比图

2.3.2 重现性试验

取白芷生品,按照相同的制备方法进行压片,重复压片5次,分别进行红外扫描测定,对所得图谱进行相似度比较,见图2。相关系数分别为1.000 0、0.997 2、0.998 9、0.996 8、0.998 2,RSD=0.13%,结果表明,该方法具有较好的重现性,符合要求。

图2 白芷红外光谱重现性对比图

图3 白芷红外光谱图稳定性对比图

2.3.3 稳定性试验

取同一白芷生品样品压片,将样品压片放入真空干燥器中保存,每隔0.5 h测定一次,对3 h内所测得图谱进行相似度比较,见图3。基本一致,图谱间的相关系数分别为1.000 0、0.998 6、0.997 4、0.997 3、0.997 2、0.996 4、0.995 5,RSD=0.15%。结果表明,样品在3 h内稳定。

2.4 样品检测

白芷生品、醋炙品,干燥后,粉碎,过100目筛。取各样品2.0 mg,按2.2.2项下方法检测。

2.5 白芷炮制前后有效成分含量测定

2.5.1 对照品溶液的制备

取欧前胡素对照品0.3 mg,精密称定,置50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成浓度0.005 875 mg/m L的对照品溶液,保存备用。

2.5.2 供试品溶液的制备

称取白芷粉末(过40目筛)0.4 g,置50 m L容量瓶中,加入色谱纯甲醇45 m L,超声处理(功率:300 W,频率:50 k Hz)1 h,取出放冷,加色谱纯甲醇至50 m L刻度线,摇匀,滤过,取续滤液即得,制成8 mg/m L的供试品溶液,保存备用。

2.5.3 色谱条件

采用InertSustainRP-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm,流动相乙腈(A)-0.1%冰乙酸水溶液(B))进行梯度洗脱(0～20 min,11%～22%A;20～40 min,22%～34%A;40～44 min,34%～38%;44～60 min,38%～39%A;60～65 min,39%～42%A;65～75 min,42%～43%A;75～85 min,43%～45%A;85～108 min,45%～65%A),流速1.0 m L·min-1,检测波长312 nm,柱温30℃,进样量30μL。各样品所得图谱见图4、图5、图6。

图4 对照品溶液色谱图

图5 白芷生品溶液色谱图

2.5.4 标准曲线的绘制

图6 醋白芷溶液色谱图

精密吸取0.005 875 mg/m L的欧前胡素对照品溶液,按照上述色谱条件,依次进样10、20、30、40 μL,注入液相色谱仪,测定欧前胡素的峰面积。以对照品进样量(μg)为横坐标,色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程Y=2.19×106X-2487,r=1.000 0。表明欧前胡素在0.058 75～0.235μg范围内线性关系良好。

2.6 方法学验证

2.6.1 精密度试验

精密吸取欧前胡素对照品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,连续进样6次,记录测得欧前胡素的峰面积。峰面积的RSD=0.12%(n=6),表明该方精密度良好。

2.6.2 重复性试验

精密称取白芷样品6份,分别按照2.3项供试品溶液的制备方法制成供试品溶液,进样10μL,测定欧前胡素峰面积,计算含量,其RSD=0.32%(n=6)。试验结果表明白芷中欧前胡素的含量测定重复性良好。

2.6.3 稳定性试验

精密称取白芷样品,按照2.3项下制备方法制成供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、24 h进样10 μL,依次测定欧前胡素峰面积,结果欧前胡素的RSD=1.64%(n=6),表明供试品中的欧前胡素在24 h内基本稳定。

2.6.4 加样回收试验

称取已知欧前胡素含量的白芷生品粉末(过40目筛)6份,加入一定量的欧前胡素对照品,按2.3.2项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液,并测定其含量,进行分析,计算加样回收率,结果见表1。

2.7 含量测定

分别精密称取白芷生品和醋炙品样品粉末,按2.3.2项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液,测定并计算两样品中欧前胡素的含量。

2.8 结果

2.8.1 白芷生品及醋炙品的一维红外光谱分析

尽管白芷生品与醋白芷的红外光谱较为相似,但在各吸收峰的强度、形状和位置上都有一定的区别,见图7。从白芷生品图谱整体上来看,165 3.64、293 0.80 cm-1分别为香豆素类及挥发油类成分的特征峰,101 8.41、108 0.14、124 2.16 cm-1为内脂环产生的吸收峰,进一步确定了以内脂环为母核结构的香豆素类成分的存在。经醋炙之后,红外图谱最明显的变化是在373 4 cm-1处出现一个小的吸收峰。此外,醋炙后293 0.80 cm-1处峰强度明显减弱,这可能与白芷醋炙之后挥发油成分有所损失有关。从总体上看,所有峰的强度均明显减弱。

图7 白芷生品和醋炙品的红外光谱对比图

2.8.2 白芷生品及炮制品的二阶导数图谱分析

见图8所示,图中标记的1处的峰,在白芷生品中不太明显,醋炙之后1处出现两个明显的单峰;与生品相比,醋炙品2处的单峰强度明显减弱;另外从图9可以看出,生品的二维图谱在3处有一小单峰,经醋炙后,该单峰几乎消失;白芷经醋炙后,在4处出现了一个小的单峰,而生品中没有。此外,白芷生品中6处单峰含右肩峰,经醋炙之后,肩峰消失;醋炙品与生品相比,5处和7处几个强的单峰强度都明显减弱;在醋炙品中,8处出现一个肩峰。上述的这些变化均可以作为通过红外光谱的二阶导数图谱判断白芷是否经醋炙的重要标志。

表1 白芷中欧前胡素加样回收率试验结果(n=6)

图8 白芷生品和醋炙品的二阶导数图谱(对比)

图9 白芷生品和醋炙品的二阶导数图谱(2 000～200 cm-1波段)

2.8.3 白芷炮制前后欧前胡素的含量测定结果

白芷炮制前后欧前胡素的含量分别为0.05%和0.04%。

3 讨论

红外光谱法从样品制备到红外测定的过程中,研磨是否充分均匀以及研磨环境是否充分干燥都可能对压片造成影响,从而造成扫描得到红外图谱的差异性,最终影响实验结果的准确性,本实验经预实验,确定白芷粉末3 mg加100 mg KBr研磨混合均匀后,扫描得到的红外图谱重复性良好。

白芷生品及醋炙品均具有较明显的红外“指纹”特征,红外光谱法快捷、简便、易操作,可作为快速鉴别原药材及其炮制品的重要工具。另外,二阶导数图谱可提高图谱的分辨率,更直观地反映出各样品的红外光谱特征,将各样品图谱间的差异放大化,更便于比较。