复方麝香注射液联合神经节苷脂对弥散性轴索损伤大鼠神经元凋亡的影响

宋国智 张学强 王霞 常成 陈建军

摘要  目的：探討复方麝香注射液联合神经节苷脂对弥散性轴索损伤（DAI）大鼠神经元凋亡及神经丝蛋白200（NF200）、生长相关蛋白43（GAP-43）、凋亡相关蛋白激酶1（DAPK1）表达的影响。方法：采用大鼠头颅瞬间旋转损伤装置建立DAI大鼠模型。将成功建立的45只DAI大鼠随机分为模型组、实验组和联合组，每组15只;另选择15只正常大鼠作为对照组。实验组大鼠腹腔注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠[30 mg/（kg·d）]，联合组大鼠腹腔注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠[30 mg/（kg·d）]+复方麝香注射液[2 mL/（kg·d）]，对照组与模型组腹腔注射等量生理盐水，连续干预7 d。采用改良神经功能缺损评分（mNSS）法评估各组大鼠的神经功能缺损情况;采用苏木精-伊红（HE）染色观察大鼠脑组织病理学变化;采用TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测各组大鼠神经元凋亡情况;采用蛋白质免疫印迹（Wb）法检测大鼠脑组织NF200、GAP-43与DAPK1蛋白表达。结果：干预第1～7天，模型组、联合组与实验组大鼠mNSS评分均逐渐降低;与对照组比较，模型组大鼠第1～7天的mNSS评分均明显升高，但联合组与实验组低于模型组，联合组低于实验组（ P <0.05）;与对照组比较，模型组大鼠神经元凋亡指数及脑组织DAPK1蛋白相对表达量均明显升高，且联合组与实验组低于模型组，联合组低于实验组（ P <0.05）;NF200、GAP-43蛋白相对表达量明显降低，且联合组与实验组高于模型组，联合组高于实验组（ P <0.05）。结论：复方麝香注射液联合神经节苷脂治疗DAI可改善大鼠神经功能缺损情况，抑制神经元凋亡，改善神经功能，其作用机制可能与上调脑组织NF200、GAP-43蛋白表达，下调DAPK1蛋白表达相关，且两药联合使用效果更佳。

关键词  弥散性轴索损伤;单唾液酸四己糖神经节苷脂;复方麝香注射液;神经元;凋亡;神经丝蛋白200;生长相关蛋白43;凋亡相关蛋白激酶1

Effects of Compound Shexiang Injection Combined with Ganglioside on Neuronal Apoptosis in Rats with Diffuse Axonal Injury

SONG Guozhi1，ZHANG Xueqiang1，WANG Xia2，CHANG Cheng1，CHEN Jianjun1

（1 Handan Central Hospital，Handan 056001，China; 2 Handan First Hospital，Handan 056001，China）

Abstract Objective： To explore effects of Compound Shexiang Injection combined with ganglioside on neuronal apoptosis and expressions of neurofilament 200（NF200），growth-associated protein 43（GAP-43）and death-associated protein kinase 1（DAPK1）in rats with diffuse axonal injury（DAI）. Methods： DAI rat models were established using a rat skull transient rotation injury device.Forty-five DAI rats successfully established were randomly divided into model group，test group and combined group，with 15 rats in each group.Another 15 normal rats were selected as control group.Rats in the test group were intraperitoneally injected with monosialotetrahexosyl ganglioside sodium[30 mg/（kg·d）]，rats in the combined group were injected intraperitoneally with monosialotetrahexosyl ganglioside sodium（30 mg·kg-1·d-1）+Compound Shexiang Injection（2 mL·kg-1·d-1），and the model and control groups were injected intraperitoneally with the same amount of normal saline，for 7 d.Modified neurological severity score（mNSS）method was used to evaluate neurological deficits in each group of rats.Hematoxylin-eosin（HE）staining was used to observe pathological changes of brain tissue in rats.TdT-mediated dUTP Notch End Labeling（TUNEL）was used to detect neuronal apoptosis in each group of rats.Protein expressions of NF200，GAP-43 and DAPK1 in rat brain tissue were detected by Western blot（Wb）method. Results： From the 1st to 7th d of the intervention，the mNSS scores of rats in the model group，the combined group and the test group were gradually decreased.Compared with the control group，the mNSS scores of the rats in the model group were significantly increased from the 1st to 7th d，but those in the combined group and the test group were lower than those in the model group，and those in the combined group were lower than those in the test group（P < 0.05）.Compared with the control group，the neuronal apoptosis index and the relative expression of DAPK1 protein in brain tissue of rats in the model group were significantly increased，and those in the combined group and the test group were lower than those in the model group，and those in the combined group were lower than those in the test group（P < 0.05）.The relative expressions of NF200 and GAP-43 proteins were significantly decreased，and those in the combined group and the test group were higher than those in the model group，and those in the combined group were higher than those in the test group（P < 0.05）. Conclusion： Compound Shexiang Injection combined with ganglioside in the treatment of DAI can improve neurological deficits in rats，inhibit neuronal apoptosis，and improve neural function.Its mechanism of action may be related to up-regulation of NF200 and GAP-43 protein expressions in brain tissue and down-regulation of DAPK1 protein expression，and the combined use of the 2 drugs is more effective.

Keywords  Diffuse axonal injury; Monosialotetrahexosyl ganglioside; Compound Shexiang Injection; Neuron; Apoptosis; Neurofilament 200; Growth-associated protein 43; Death-associated protein kinase 1

中图分类号：R285.5 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.015

弥散性轴索损伤（Diffuse Axonal Injury，DAI）是头部受到外力作用后发生成角或旋转加/减速运动所造成的一种原发性脑实质的损伤，以轴索损伤为主要改变，上脑干背外侧象限局灶性出血、胼胝体局灶性出血和轴索的广泛损害是其特征性病理改变，但由于目前其发病机制尚不明确，临床尚无治疗DAI的有效手段[1]。神经节苷脂是一种酸性鞘糖脂，是临床较常用的神经营养药物之一，可维持细胞膜结构和功能的完整性，但单独使用修复受损神经细胞的作用有限[2]。中医学理论认为，DAI属血瘀症范畴，头部暴力伤后，脑络损伤，导致血流不畅，气血逆乱，故伤后昏迷时间长，治则以醒神开窍、活血化瘀为主[3]。复方麝香注射液是在安宫牛黄丸组方基础上改制而成的水溶性注射液，具有行气活血、清热凉血及醒神止痉等功效，有扩张血管、抗惊厥、镇静与兴奋中枢神经系统的作用，临床多用于治疗神经系统及脑血管疾病[4]。而目前复方麝香注射液联合神经节苷脂治疗DAI尚未见报道，因此开展本研究，以期能够为其临床推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠，6周龄，体质量200～220 g，购于上海灵畅生物科技有限公司，动物生产合格证号为SCXK（沪）2018-0003。饲养环境与条件：上海灵畅生物科技有限公司屏障环境动物实验室，每笼5只，温度（25±2）℃，湿度（55±2）%，光照明暗时间比为12 h/12 h，自由获取食物和水。

1.1.2 药物 复方麝香注射液[神威药业（四川）有限公司，生产批号：19030331];单唾液酸四己糖神经节苷脂钠（北京赛升药业股份有限公司，生产批号：20180112）。

1.1.3 试剂与仪器 TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）凋亡试剂盒（美国Promega公司，生产批号：200-664-3）;兔抗鼠神经丝蛋白200（NF200）抗体（英国Abcam公司，生产批号：1392503Z）;兔抗鼠生长相关蛋白43（GAP-43）抗体（美国Santa Cruz公司，生产批号：PB11058）;兔抗鼠凋亡相关蛋白激酶1（DAPK1）抗体（美国Sigma公司，生产批号：L750N46）;石蜡切片机（上海三崴医疗设备有限公司，型号：HM340E型）;高速冷冻离心机（美国Beckman公司，型号：Couvter型）;光学显微镜（德国LEICA公司，型号：DM LB2型）;多功能酶标仪（瑞士TECAN公司，型号：M200 PRO型）;分析软件（美国Media Cybernetics公司，型号：Image-Pro Plus v6.0）等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 采用大鼠头颅瞬间旋转损伤装置建立DAI大鼠模型：按照2 mL/kg的剂量用100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠固定于旋转损伤装置，进行大鼠头颅沿冠状面侧向旋转90°的瞬间旋转致伤，并快速制动静止。将成功建立的45只DAI大鼠随机分为模型组、实验组及联合组，每组15只，另选择15只正常大鼠作为对照组[5]。

1.2.2 干预方法 实验组大鼠腹腔注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠[30 mg/（kg·d）]，联合组大鼠腹腔注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠[30 mg/（kg·d）]+复方麝香注射液[2 mL/（kg·d]，对照组与模型组腹腔注射等量生理盐水，连续干预7 d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 改良神经功能缺损评分（mNSS）法[6]評估各组大鼠的神经功能缺损情况 各组大鼠于干预1、3、5、7 d采用mNSS法评估各组大鼠神经功能缺损情况，主要包括：运动、感觉、平衡木及反射4项测试，记分为0～18分，分数越高，表明脑损伤越严重。

1.2.3.2 苏木精-伊红（HE）染色[7]观察大鼠脑组织病理学变化 干预第7天进行mNSS评分后，采用颈椎脱臼法处死各组大鼠，解剖、采集大鼠脑组织，4%多聚甲醛固定24 h，经脱水、包埋、切片（5 μm）等制作石蜡切片，行常规HE染色，光学显微镜下观察各组大鼠脑组织病理学特点。

1.2.3.3 TUNEL法检测大鼠神经元凋亡情况 取石蜡切片，按照TUNEL凋亡试剂盒说明书提供的步骤进行TUNEL染色[8]。于倒置荧光显微镜下观察阳性细胞，即凋亡细胞，细胞核染为绿色为阳性细胞，每个标本随机选择5个视野，计算细胞凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.3.4 蛋白免疫印迹（Wb）法[9]检测大鼠脑组织NF200、GAP-43与DAPK1蛋白表达 取-80 ℃保存的脑组织，加入裂解液匀浆，离心后取上清液，提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取20 μg蛋白样品上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），湿转膜后封闭，加入1∶ 1 000稀释的一抗NF200、GAP-43与DAPK1，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育2 h。采用Image-Pro Plus v6.0分析软件进行蛋白条带的灰度值分析，以目的蛋白与内参β-actin灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料以 （ ±s） 表示，组间比较采用 t 检验，以 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠mNSS评分比较 干预第1～7天，模型组、联合组与实验组大鼠mNSS评分均逐渐降低;与对照组比较，模型组大鼠第1～7天的mNSS评分均明显升高，但联合组与实验组低于模型组，联合组低于实验组（ P <0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠脑组织病理学变化 对照组大鼠脑组织结构完整，未见异常，神经元数量多，形态规则;模型组大鼠脑组织结构疏松，间质水肿，轴突出现断裂变性，神经元数量明显减少，细胞皱缩、核深染，且大部分神经元水肿并坏死;联合组与实验组大鼠脑组织病变明显改善，神经元数量较模型组显著增多，坏死程度减轻，神经元形态趋于正常，且联合组大鼠脑组织病变改善程度优于实验组。见图1。

2.3 各组大鼠神经元凋亡情况 对照组、模型组、联合组与实验组大鼠神经元凋亡指数分别为 （8.64±3.21）%、（51.22±5.37）%、（16.84±4.22）%、（36.51±3.87）%。与对照组比较，模型组大鼠神经元的凋亡指数明显升高，且联合组与实验组低于模型组，联合组低于实验组（ P <0.05）。见图2。

2.4 各组大鼠脑组织NF200、GAP-43与DAPK1蛋白表达 与对照组比较，模型组大鼠脑组织NF200、GAP-43蛋白相对表达量明显降低，且联合组与实验组高于模型组，联合组高于实验组（ P <0.05）;模型组DAPK1蛋白相对表达量升高，且联合组与实验组低于模型组，联合组低于实验组（ P <0.05）。见表2，图3。

3 讨论

DAI是一种常见且危重的颅脑损伤，可导致选择性大脑白质轴突水肿、轴索断裂等病理改变，以长时间意识障碍为典型临床表现，临床诊断较困难且预后差[10-11]。神经节苷脂是含唾液酸的一类膜糖脂的总称，是组成细胞膜结构和维持膜功能的基本物质，与轴突的生长、突触的形成及神经元的分化等密切相关，已被广泛用于临床治疗脊髓损伤、缺氧缺血性脑病、阿尔兹海默病及糖尿病周围神经病变等，但由于其单独使用时疗效有限，故常需与相应药物联合使用[12]。中医学理论认为，DAI是由于暴力引起人体内部气血经络脏腑受损或功能失调而产生一系列症状，属头部内伤。伤后气机不利，闭塞机窍，致患者昏迷不醒;气为血之帅，血为气之母，气血不调是百病发生的根本;伤血必致伤气，先见气滞，继则见气虚，严重者气脱，瘀血经久不散，损伤难愈，因此，颅脑损伤以气虚血瘀多见。复方麝香注射液由石菖蒲、麝香、冰片、郁金、广藿香、薄荷等主要成分组成，石菖蒲、广藿香、薄荷芳香化浊、行气化湿、辟秽止呕，以解痰瘀热邪诸毒，醒神益智;麝香善于走窜，活血、行气止痛、开窍醒脑，为醒神回苏之要药;冰片有清热解毒、消肿止痛、去翳明目、通诸窍的功效;郁金疏脾解郁、活血化瘀、清心开窍，全方具有祛痰开窃、醒脑安神之功效，同时也可降低血脑屏障通透性，缩短昏迷时间，减轻脑水肿，改善脑供血、供氧等[13]。药理研究[14]表明，石菖蒲具有调节中枢神经系统、心血管系统、消化系统与内分泌系统功能的作用;麝香为通关利窍之药，可显著减轻脑水肿、改善血液流变性及细胞聚集、抑制炎性反应早期的渗出性水肿等;郁金可改善缺血周围半暗带的微循环和血液流变黏稠度。有研究[15]报道，复方麝香注射液治疗早期高血压性脑出血患者，临床疗效显著，可促进患者神经功能恢复，提高其日常生活能力，利于预后，值得临床推广使用。本研究结果显示，联合组与实验组大鼠第1～7天的mNSS评分明显低于模型组，且联合组低于实验组，提示复方麝香注射液与神经节苷脂治疗DAI均可改善神经功能缺损情况，缓解病情，且两药联合使用效果更佳。

DAPK1在脑外伤、脑缺血等信号刺激下被激活，可通过多种途径介导神经元损伤、死亡，损害神经功能;当颅脑损伤时，神经元细胞可大量合成NF200，NF200进而发挥促进神经元功能修复与神经轴突再生的作用;GAP-43具有促进神经发育、轴突再生与突触重建等作用[16]。有研究[17]显示，凋亡相关蛋白DAPK1可致脑缺血损伤后神经元细胞凋亡，从而损伤脑神经组织，破坏神经功能。有研究[18]显示，参芎葡萄糖注射液可促进损伤脊髓的功能恢复，其机制可能与上调损伤区脊髓GAP-43、NF200表达有关。李振华等[19]研究发现，神经节苷脂治疗急性脊髓损伤大鼠，可改善脊髓损伤程度，缓解运动障碍，其机制可能与上调B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）表达，抑制神经元凋亡有关。目前尚无关于复方麝香注射液或神经节苷脂对NF200、GAP-43、DAPK1作用的相关报道，本研究结果显示，联合组与实验组大鼠神经元凋亡指数及脑组织DAPK1蛋白相对表达量均低于模型组，NF200、GAP-43蛋白相对表达量高于模型组，提示复方麝香注射液与神经节苷脂治疗DAI均可抑制神经元凋亡，上调脑组织NF200、GAP-43蛋白表达，同时下调DAPK1蛋白表达，从而保护神经细胞，改善神经功能。

综上所述，复方麝香注射液联合神经节苷脂治疗DAI可改善大鼠神经功能缺损情况，抑制神经元凋亡，上调脑组织NF200、GAP-43蛋白表达，同時下调DAPK1蛋白表达，从而保护神经细胞，改善神经功能，且两药联合使用具有协同作用，这为临床治疗DAI提供了新方向，也为复方麝香注射液与神经节苷脂的推广应用提供了理论依据。

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（2020-02-05收稿 责任编辑：王明）

基金项目：河北省2016年度医学科学研究重点课题计划项目（20160027）作者简介：宋国智（1969.06—），男，硕士研究生，主任医师，研究方向：神经外科方向，E-mail：15631008622@163.com