石见穿多糖通过Wnt/β-catenin 信号通路调控骨肉瘤细胞的迁移和侵袭

李 增，张 瑞，张晓坚，杜书章

（郑州大学第一附属医院 药学部，河南 郑州 450000）

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是世界范围内最常见的恶性骨肿瘤之一，发病人群多为儿童和青少年，男性发病率高于女性［1］，OS 具有强的转移性和侵袭性，临床上，该病具有预后性差、致死率高等特点，一般治疗手段为化疗加上手术切除，但其恶化程度高，且化疗药耐受性高，因此患者治疗后5 年存活率不足70%［2］，此外，化疗药价格昂贵，治疗效果差强人意，且副作用较大。

Wnt 通路是生物体细胞内一条进化过程中高度保守的信号通路，近年来在肿瘤细胞的研究中被广泛关注。Wnt 信号通路分为4 个分支，分别为经典的Wnt/β-catenin 信号通路、Wnt/Ca2+信号通路、调节纺锤体方向和非对称细胞分裂的路径以及平面细胞极性路径［3］，其中Wnt/β-catenin 经典路径是研究最多的一条分支，该信号路径能调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、细胞间质化等多个方面的生物学功能［4］。大量研究表明，Wnt/β-catenin 通路的异常激活与多种癌症有关［3］，同时有研究证实，Wnt/β-catenin 通路与OS 的发生发展密切相关［4］。

石见穿为唇形科鼠尾草属植物华鼠尾草，其有效成分石见穿多糖已被证实具有良好的抗癌效果，对多种肿瘤细胞有抑制作用［5］，但其对OS 的作用影响尚鲜有报道。本研究拟探讨石见穿多糖能否对人OS MG63 细胞系的生物学行为产生影响，及其可能存在的作用机制，为临床OS 的治疗寻找新的有效药物提供理论支撑。

1 材料

1.1 细胞株 人OS MG63 细胞株购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物与试剂 石见穿多糖（SBPs）购自上海将来实业股份有限公司（国药准字H20180625）；含双抗的1640 培养基（批号M0655）、胎牛血清（批号M4667）购自美国Gibco 公司；TRIzol（批号A001-3-2）、逆转录试剂盒（批号A005-1-2）购自美国Invitrogen 公司；β-catenin 引物由上海生工生物工程有限公司合成；兔抗人Vimentin（批号ab190321）、E-cadherin（批号ab180323）一抗购自上海艾博抗贸易有限公司；鼠抗人β-actin（批号AF5001）购自碧云天生物技术有限公司；Transwell小室（批号ab195443）购自上海艾博抗贸易有限公司。

1.3 仪器 双人水平超净工作台（上海巴玖实业有限公司）；二氧化碳细胞孵育箱（美国Thermo公司）；低温高速离心机（美国Thermo 公司）；S1000 型PCR 扩增仪（美国Bio-Rad 公司）；电转仪系统（美国Bio-Rad 公司）；DYC-p32 型电泳仪（上海巴玖实业有限公司）；转膜仪（南京生兴生物经济技术有限公司）；图像记录分析系统：大连Jim-X Scientific 公司；倒置荧光显微镜（DMIL LED Fluo，德国Leica 公司）。

2 方法

2.1 细胞复苏和培养 将冻存的人OS MG63 细胞株解冻、复苏，培养于含10%胎牛血清和1%双抗的1640 培养液中，于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，待其贴壁。每天注意观察细胞的生长状态，以细胞液的颜色、形状判断是否需要换液，换液周期一般为2～3 d。待细胞生长汇合度达到80%以上时，则需要进行传代，传代比例一般为1∶5～1∶8。

2.2 划痕实验检测石见穿多糖对人OS MG63 细胞迁移能力的影响 将人OS MG63 细胞以约5×105/孔接种于6 孔板，于细胞培养箱中继续培养16 h 后，加入含不同浓度石见穿多糖的细胞培养液，加入药物浓度分别为 0（对照组）、0.25、0.5、1 mg/mL，每组设置6 个复孔［6］。在培养箱中继续培养24 h，用不含FBS 的RPMI-1640 培养液饥饿处理12 h；用10 μL 的移液枪头垂直于板面划痕，每4 小时观察一次细胞迁移状态，于倒置荧光显微镜下拍照，用作图软件处理，比较每组细胞0 h 和24 h 的划痕宽度。

2.3 Transwell 小室检测石见穿多糖对人OS MG63细胞侵袭能力的影响 将OS MG63 细胞与不同浓度的石见穿多糖（0、0.25、0.5、1 mg/mL）共培养24 h，加入不含FBS 的培养基，饥饿处理12 h，胰蛋白酶消化后，将细胞洗涤、离心，用不含FBS的培养基重悬细胞，调整细胞浓度约2×105/mL；将小室置于24 孔板内，加入300 μL 含10%FBS 的RPMI-1640 培养液，室温下静置30 min 左右，使基质胶水化，向外室内加入500 μL 含10%FBS 的RPMI-1640 培养液，将200 μL 单细胞悬液接种于小室内，培养24 h 后，进行GISMA 染色，向每孔加入400 μL A 液染色4 min，加入800 μL B 液染色8 min，用棉签擦拭小室内侧，流水冲洗染液；用手术刀片将膜取下，置于载玻片上，于倒置显微镜下观察、计数并拍照；每张玻片取上下左右中5个视野计数细胞，取平均数。

2.4 RT-PCR 检测石见穿对人OS MG63 细胞βcateninmRNA 表达的影响 将OS MG63 细胞与不同浓度的石见穿多糖（0、0.25、0.5、1 mg/mL）共培养24 h，TRIzol 提取细胞总RNA，行逆转录反应。取2 μLRNA 进行PCR 扩增，引物序列，内参β-actin正向5′-CTACGTCGGCTTAGCGCAAC-3′，反向5′-TAGGCTTAGCTAGCTTCGAA-3′；β-catenin正向 5′-TAGGCTTAGCTAGCCTAGCC-3′，反向 5′-TAGCGGCTATCGGCTAGCAC-3′，扩增条件为94 ℃预变性2 min，1 个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 个循环；72 ℃总延伸6 min。取5 μL PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外线投射仪下观察电泳条带，分析系统分析目的基因和参比基因的条带灰度值。

2.5 Western blot 检测石见穿对人OS MG63 细胞Vimentin、E-cadherin 蛋白表达的影响 将OS MG63 细胞与不同浓度的石见穿多糖（0、0.25、0.5、1 mg/mL）共培养24 h，用RIPA 细胞裂解液裂解，提取蛋白质，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后将蛋白质转移至NC 膜，置于含有5%脱脂奶粉的TBST 中摇育封闭2 h；加入稀释后的一抗，TBST 洗涤；加入二抗，TBST 洗涤，ECL显色；将胶片扫描后用Bandscan 5.0 软件进行灰度分析。

2.6 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行统计分析。计量资料以（）表示，多组间的比较用方差分析分析，组内两两比较用LSD-t检验。以P≤0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 石见穿多糖对人OS MG63 细胞迁移能力的影响 石见穿多糖组划痕比值（24 h/0 h）高于对照组（P＜0.01），且随着药物浓度的增加，划痕比值随之增加，呈剂量依赖性，说明石见穿多糖能抑制细胞的迁移。Transwell 结果显示，石见穿多糖组细胞透过上室Matrigel 胶的数量少于对照组（P＜0.01），随着石见穿多糖浓度的增加，侵袭细胞数逐渐减少，呈剂量依赖性，说明石见穿多糖能抑制细胞的侵袭能力。见图1～2、表1。

图1 划痕检测各组人OS MG63 细胞迁移（×40）Fig.1 Detection of human OS MG63 cells migration by scratch test（×40）

图2 Transwell 检测各组人OS MG63 细胞侵袭能力（×20）Fig.2 Detection of the invasion ability of human OS MG63 cells in each group by Transwell（×20）

表1 石见穿多糖对人OS MG63 细胞迁移、侵袭能力的影响（，n=3）Tab.1 Effects of SBPs on the migration and invasion ability of human OS MG63 cells（，n=3）

表1 石见穿多糖对人OS MG63 细胞迁移、侵袭能力的影响（，n=3）Tab.1 Effects of SBPs on the migration and invasion ability of human OS MG63 cells（，n=3）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与0.25 mg/mL 石见穿多糖组比较，##P＜0.01；与0.5 mg/mL 石见穿多糖组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.2 石见穿多糖对人OS MG63 细胞β-cateninmRNA 表达的影响 石见穿多糖组β-cateninmRNA表达低于对照组（P＜0.01），且随着药物浓度的增加，β-cateninmRNA 的表达逐渐减弱。见图3、表2。

图3 RT-PCR 检测各组人OS MG63 细胞β-catenina mRNA表达Fig.3 Detection of β-catenina mRNA expression of human OS MG63 cells in each group by RT-PCR

3.3 石见穿多糖对人OS MG63 细胞E-cadherin、Vimentin 蛋白表达的影响 石见穿多糖组细胞E-cadherin蛋白的表达高于对照组（P＜0.01），且随着药物浓度的增加，呈剂量依赖性；石见穿多糖组细胞Vimentin 蛋白表达弱于对照组（P＜0.05，P＜0.01），且该抑制作用随着药物浓度的增加而增加。见图4、表2。

图4 Western blot 检测各组人OS MG63细胞蛋白表达Fig.4 Detection of protein expression of human OS MG63 cells in each group by Western blot

表2 石见穿多糖对人OS MG63 细胞β-catenin mRNA 及E-cadherin、Vimentin 蛋白表达的影响（，n=3）Tab.2 Effects of SBPs on the expression of β-catenin mRNA，E-cadherin and Vimentin protein in human OS MG63 cells（，n=3）

表2 石见穿多糖对人OS MG63 细胞β-catenin mRNA 及E-cadherin、Vimentin 蛋白表达的影响（，n=3）Tab.2 Effects of SBPs on the expression of β-catenin mRNA，E-cadherin and Vimentin protein in human OS MG63 cells（，n=3）

注：与对照组比较，* P ＜0.05，**P ＜0.01；与0.25 mg/mL 石见穿多糖组比较，## P ＜0.01；与0.5 mg/mL 石见穿多糖组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

4 讨论

迁移和侵袭是OS 细胞最主要的特点，也是导致癌症恶化和扩散的最主要原因［7］。上皮间质转化（epothelial-mesenchymal transition，EMT）指源于上皮的肿瘤细胞失去极性而向具有间质表型细胞转化的过程，在此过程中，上皮细胞粘附性降低，极性消失，使细胞的转移和侵袭能力增强［8］。Wnt/β-catenin 信号通路是导致EMT 的重要因素［8］，正常细胞β-catenin 与E-cadherin 相结合形成复合体，维持细胞的极性，使细胞间接触稳定，限制细胞的移动；当Wnt 通路被异常激活时，该复合体被破坏，细胞 E-cadherin 表达下降，Vimentin 等能刺激细胞移动的蛋白表达上调，各种蛋白相互作用，使细胞失去极性，细胞间连接变得疏松，从而导致细胞粘附力下降，移动能力增强，发生迁移或侵袭［7-8］。有研究证实，在OS 细胞中，Wnt 信号通路的异常激活促进了肿瘤的增殖和早期肺部转移，而抑制Wnt 通路的活性可以抑制OS 干细胞的自我更新，从而抑制癌症的侵袭性和耐药性［9］。

石见穿多糖在临床上多用于治疗各种感染性疾病，近年来，大量药理实验证实其对多种细胞系具有细胞毒性作用，能诱导细胞凋亡和线粒体损伤，同时能通过对血管内皮生长因子、白细胞介素的调控而抑制肿瘤细胞的转移和侵袭［10］，但其对于膀胱癌细胞的影响尚鲜有研究。本研究发现，石见穿多糖能显著抑制人OS 细胞的转移和侵袭，且在一定范围内呈现剂量依赖性。

β-catenin 是该通路的核心因子，大量研究发现，癌症的发生与Wnt/β-catenin 信号通路的异常激活有关［3］，结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌细胞质都存在β-catenin 的聚集［11-12］，有学者发现OS 细胞核内 β-catenin 的表达显著增加，而敲除β-catenin后，膀胱癌细胞的迁移核侵袭能力都有所减弱［13］。本研究以β-catenin 作为Wnt 经典通路的标志因子，用不同浓度的石见穿多糖与人OS MG63 细胞共培养24 h，石见穿多糖能显著抑制细胞内β-cateninmRNA 表达，且呈现剂量依赖性，提示石见穿多糖可能对人OS 细胞内Wnt/β-catenin信号通路的活性具有抑制作用。

E-cadherin 的表达缺失是EMT 过程中的重要标志。在许多类型的肿瘤中，可以通过恢复E-cadherin 的表达而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭［7，14］。体外研究证实，通过给E-cadherin 表达缺陷的细胞转染该蛋白基因后，肿瘤的侵袭性消失［15］。本研究发现，石见穿多糖能刺激细胞内E-cadherin 的表达，且随着药物浓度的增加，E-cadherin的表达随之增加，推测石见穿多糖可能通过刺激人OS MG63 细胞内E-cadherin 表达而抑制EMT 过程，从而减弱细胞的迁移和侵袭能力。

同一肿瘤细胞系中，占主导地位的E-cadherin负性化的作用导致癌症细胞播散，并增加了细胞内Vimentin 的活性。Vimentin 属于中间丝家族成员，其主要作用在于调节细胞收缩、粘附和迁移其作为间质细胞的标志性蛋白，是EMT 途径另一重要的蛋白之一［16］。实验结果发现，石见穿多糖在刺激人OS MG63 细胞内E-cadherin 表达的同时，抑制了Vimentin的表达。石见穿多糖可能通过刺激人OS细胞内E-cadherin 表达，抑制Vimentin 的表达，而阻断细胞内EMT 过程，从而减弱细胞的迁移和侵袭能力。

综上所述，石见穿多糖能抑制人OS MG63 细胞的迁移和侵袭能力，这种作用可能使通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路的活性，从而阻断细胞内EMT 过程而引起的。