苦瓜皂苷对CCl4 诱导大鼠肝纤维化的保护作用

张晨宇，袁志军，万林峰，鄢雨晴，曾 芳

（1.宜春市人民医院 药学部，江西 宜春 336000；2.武汉协和医院 药学部，湖北 武汉 430022）

肝纤维化是指由化学毒物性损伤、慢性肝炎病毒感染、非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝病、先天性代谢缺陷、酗酒等因素引起的以肝内结缔组织异常增生为主要特征的病理、生理过程［1］。肝纤维化严重危害人类健康，在全世界常见的死亡原因中排名第14 位，发病率及死亡率均呈逐渐增加趋势［2］。目前临床上治疗肝纤维化的主要药物包括联苯双酯、水飞蓟素、熊去氧胆酸、西列丙胺、维甲酸及干扰素γ 等，但这些药物疗效并不理想，加之较大的毒副反应和昂贵的治疗费用，极大的阻碍了此类疾病的治疗［3］。中药治疗肝纤维化具有疗效高、低毒副反应、费用低等优点，逐渐得到人们的重视［4］。

苦瓜入药历史十分悠久，为葫芦科苦瓜属植物，因具有特殊苦味而得名，在亚洲许多地区和国家均有记载［5］。研究表明，苦瓜具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、提高免疫力、降低胆固醇及抗艾滋病等多种显著的生理活性，其活性成分主要为皂苷、酚类、生物碱、多糖和多肽等［6-8］。苦瓜及其活性成分对肝损伤的作用多见报道，如苦瓜多糖对CCl4诱导的小鼠肝损伤具有保护作用［9］；苦瓜甾醇对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤具有明显保护作用，机制涉及清除自由基能力的提高及酶防御系统功能的维持等［10］；苦瓜皂苷可通过降低机体氧化应激水平，减轻肝细胞脂肪变性［11］。但是关于苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠肝组织的保护作用及机制研究鲜有报道。因此，本研究拟通过建立CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型，在探讨苦瓜皂苷对肝纤维化保护作用的基础上，进一步明确其对肝组织抗氧化能力及TGF-β1/Smad信号通路的影响。

1 材料

1.1 动物 SD 大鼠，48 只，雄性，体质量（200±20）g，购自中国科学院斯莱克实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（京）2011-0012；自由饮水，常规条件饲养，饲养1周后用于正式实验。

1.2 药物和试剂 苦瓜皂苷（批号20170125，纯度为87.2%）购自西安文竹生物科技有限公司，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠配制所需浓度的混悬液；联苯双脂（批号160123）购自北京协和制药厂；CCl4（批号C128126）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，临用前用橄榄油稀释；AST、ALT、LN 及HA 检测试剂盒（批号分别为20180216、20171209、20180321、20171126）购自上海研晶生物科技有限公司；CAT、SOD 及MDA 等抗氧化能力检测试剂盒（批号分别为180105、180417、171021）购自南京建成生物工程研究所；TGF-β1、p-Smad 3 多克隆抗体（批号分别为SC-7982、SC-11769）购自美国Santa Cruz 公司。

1.3 仪器 AB-160 型分析天平（美国Denver 公司）；TDL-40B 型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；DW-HL388 型超低温冰箱（中科美菱低温科技有限公司）；UV1800 型紫外可见分光光度计（上海菁华仪器有限公司）；WD-2 102 A型全自动酶标仪（北京六一仪器厂）；Mini-PROTEAN Tetra型蛋白电泳及转印系统（美国Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模、分组及给药 将SD 大鼠随机分为正常对照组、模型组、联苯双酯组及苦瓜皂苷低、中、高剂量组，每组8 只；苦瓜皂苷低、中、高剂量组给药剂量设置依据预实验结果。除正常对照组外，每组大鼠背部皮下均注射CCl4（1 mL/kg），2 次/周，共12 周，正常对照组背部皮下注射等体积橄榄油；第5 周时，联苯双酯组灌胃150 mg/kg 联苯双酯，苦瓜皂苷低、中、高剂量组分别灌胃给予150、300、600 mg/kg 苦瓜皂苷，正常对照组和肝纤维化模型组灌胃给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠；1 次/d，持续至第12 周，期间密切观察大鼠一般状态。

2.2 血清AST、ALT、LN 及HA 水平检测 末次给药后24 h，水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血；3 000 r/min 离心20 min，分离血清；按照试剂盒说明书中的操作方法，检测苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠血清AST、ALT、LN 及HA水平的影响。

2.3 肝组织抗氧化能力检测 腹主动脉取血后，剖取大鼠肝脏；固定部位取500 mg 肝组织，经预冷的生理盐水漂洗冲去表面血液及滤纸拭干后，加适量生理盐水制备10%肝组织匀浆液；3 000 r/min 离心20 min，吸取上清液分装至1.5 mL 离心管中，-80 ℃冰箱中冻存备用。采用比色法分别检测苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠肝组织CAT、SOD 及MDA水平的影响。

2.4 肝组织TGF-β1 及p-Smad 3 表达检测 称取固定部位的肝组织100 mg，经预冷的生理盐水漂洗冲去表面血液及滤纸拭干后，加入RIPA 细胞裂解液，置于冰水浴中进行裂解（20 min），然后离心（10 000 r/min，15 min）；BCA法测蛋白浓度。取等量蛋白（10 μg）行10% SDS-PAGE 电泳，常规方法进行转膜、封闭后，加入TGF-β1 及p-Smad 3一抗（均为1∶1 000），室温孵育2 h；经缓冲液TBST 洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体（二抗），继续室温孵育1 h，增强化学发光法显影。采用图像分析软件分析各条带光密度值，通过目的条带光密度与内参（GAPDH）光密度的比值进行半定量。

2.5 HE 染色 采用中性甲醛（4%）固定肝组织，经乙醇脱水及石蜡包埋等步骤后，行连续切片后封闭。常规方法进行HE 染色，镜下观察肝组织病理形态。

2.6 统计学分析 应用SPSS 15.0 软件进行分析。所得数据以（）表示，多组间比较采用方差分析；以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠一般状态的影响 正常对照组大鼠体质量稳步增加，一般状态良好，反应敏捷，皮毛光泽；肝纤维化模型组大鼠体形消瘦，一般状况较差，反应迟钝，皮毛缺少光泽；苦瓜皂苷组一般状态好于肝纤维化模型组，反应较敏捷，皮毛基本光泽。

3.2 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠血清AST 及ALT 水平的影响 与正常对照组比较，肝纤维化模型组大鼠血清AST、ALT 水平升高（P＜0.05）；与模型组大鼠比较，低、中、高剂量苦瓜皂苷组大鼠血清AST、ALT 水平均降低（P＜0.05）。见表1。

表1 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠血清AST、ALT 水平的影响（，n=8）

表1 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠血清AST、ALT 水平的影响（，n=8）

注：与正常对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

3.3 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠血清LN 及HA 水平的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠血清LN、HA 水平升高（P＜0.05）；与肝纤维化模型组大鼠比较，低、中、高剂量苦瓜皂苷组大鼠血清LN 水平降低（P＜0.05），中、高剂量苦瓜皂苷组HA 水平降低（P＜0.05）。见表2。

表2 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠血清LN 及HA 水平的影响（，n=8）

表2 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠血清LN 及HA 水平的影响（，n=8）

注：与正常对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

3.4 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠肝组织抗氧化能力的影响 与正常对照组比较，肝纤维化模型组大鼠肝组织CAT、SOD 水平降低，而MDA 水平升高（P＜0.05）；与肝纤维化模型组大鼠比较，中、高剂量的苦瓜皂苷组大鼠肝组织CAT 水平和低、中、高剂量的苦瓜皂苷组SOD 水平均升高，而苦瓜皂苷各剂量组MDA 水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠肝组织抗氧化能力的影响（，n=8）

表3 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠肝组织抗氧化能力的影响（，n=8）

注：与正常对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

3.5 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1 及p-Smad 3表达的影响 与正常对照组比较，肝纤维化模型组大鼠肝组织TGF-β1 及p-Smad 3 表达增加（P＜0.05）；与肝纤维化模型组大鼠比较，低、中、高剂量的苦瓜皂苷组大鼠肝组织TGF-β1 及p-Smad 3 蛋白表达均降低（P＜0.05）。见表4、图1。

表4 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1 及p-Smad 3表达的影响（，n=8）

表4 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1 及p-Smad 3表达的影响（，n=8）

注：与正常对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

图1 Western blot 检测各组TGF-β1、p-Smad 3 蛋白表达

3.6 苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠肝组织病理形态的影响 正常对照组大鼠肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，形态正常，肝小叶完整；肝纤维化模型组大鼠肝细胞排列紊乱、肿胀严重且许多肝细胞脂肪变性呈空泡状，可见大量纤维结缔组织增生，肝小叶破坏严重；与肝纤维化模型组大鼠比较，苦瓜皂苷组肝细胞排列基本正常，病变程有不同程度的缓解。见图2。

图2 HE 染色检测苦瓜皂苷对肝纤维化大鼠肝组织病理形态的影响（×200）

4 讨论

本研究通过灌胃给予肝纤维化模型大鼠低、中、高剂量的苦瓜皂苷后，发现其可以有效降低模型大鼠血清AST及ALT 水平。AST 和ALT 为世卫组织推荐的检测肝功能损伤与否的最敏感指标，当肝功能受损时，血清AST 和ALT水平显著增加［12］；而苦瓜皂苷可以有效降低模型大鼠血清AST 和ALT 水平，表明其具有保护肝脏损伤作用。在肝纤维化过程中，细胞外基质的代谢产物如LN 和HA 等释放入血，因而血清中LN 和HA 水平可反应肝纤维化程度［13］。本研究发现，与肝纤维化模型组大鼠比较，低、中、高剂量的苦瓜皂苷组大鼠血清LN 及HA 水平均有不同程度的降低，其中各剂量组的LN 水平及中、高剂量组的HA 水平呈显著性降低，以上结果进一步表明苦瓜皂苷具有减轻模型大鼠肝纤维化程度的作用。

肝纤维化病理机制复杂，大量证据表明，多种因素所致肝纤维化均伴有氧化应激水平的增加，氧化应激与肝纤维化发病机制之间的关系受到越来越多的重视［14］。国内外很多学者尝试应用抗氧化剂治疗各种病因所致的肝纤维化，取得较好效果，如白藜芦醇、维生素E、褪黑激素及水飞蓟素等均可以通过抑制脂质过氧化反应，降低氧化应激水平，进而起到减轻肝纤维化程度的作用［15］。由于CAT 及SOD 是细胞内清除氧自由基的主要抗氧化物酶，而MDA 是脂质过氧化过程中的最终产物，因此，通过检测CAT、SOD 及MDA 水平可以反映细胞受氧化损伤的严重程度［16］。本研究结果发现，与肝纤维化模型组大鼠比较，各剂量的苦瓜皂苷组大鼠肝组织CAT 和SOD 水平均显著升高，而MDA 水平则显著降低；以上结果提示，苦瓜皂苷对CCl4诱导的肝纤维化大鼠的保护作用可能与抗氧化作用有关。

TGF-β1/Smad 信号通路在肝纤维化的发生及发展中具有重要作用，TGF-β1 具有刺激肝星形细胞增殖与活化的作用，而Smad 蛋白可将TGF-β1 信号由细胞浆转导至细胞核，从而调控LN、HA 及羟脯氨酸等蛋白的表达，最终导致肝纤维化的发生与进展［17-18］。研究表明，夏枯草总三萜对CCl4诱导的肝纤维化大鼠具有较好的保护作用，其机制可能与调控TGF-β1/Smad 信号通路及下调p-ERK 表达有关［19］。丹参素及白芍总苷等对肝纤维化大鼠的保护作用也均与抑制TGF-β1/Smad 信号通路的活化有关［20-21］。本研究结果同样发现，灌胃给予肝纤维化模型大鼠低、中、高剂量的苦瓜皂苷后，模型大鼠肝组织TGF-β1 及p-Smad 3 蛋白表达水平显著降低。此结果提示，苦瓜皂苷对CCl4诱导的肝纤维化大鼠的保护作用可能与抑制TGF-β1/Smad 信号通路的活化有关。

综上所述，苦瓜皂苷对CCl4诱导的肝纤维化大鼠具有较好的保护作用，该作用与抗氧化及抑制TGF-β1/Smad 信号通路有关。