基于LC-MS 和网络药理学探讨银杏酮酯治疗合并心血管疾病的新型冠状病毒肺炎的研究

刘新娟，江美芳，俞 婷，王丹丹，朱国琴，高 崎，*

（1.上海中医药大学，上海 201203；2.上海上药杏灵科技药业股份有限公司，上海 201703）

银杏Ginkgo biloba L.为银杏科银杏属植物，常以其叶和种子入药，药典记载银杏叶归心、肺经，有活血化瘀、敛肺平喘等功效。银杏叶进行醇提、水提、柱层析、双层吸附等生产工艺后获得银杏叶制剂GBE50，其中银杏黄酮高达44%以上，GBE50 制剂包括分散片、滴丸等，临床用于治疗心血管疾病［1］。本文通过LC-MS 技术获得银杏酮酯5 大类成分，其中银杏总黄酮有抗炎和抗心肌缺血作用［2］；双黄酮有抗凝血和抗感染作用［3］；萜内酯有抗心肌梗死、保护心血管作用［4］；有机酸成分具有抗氧化作用［5］；黄烷醇有抗流感病毒作用等［6］。综合认为GBE50 除了有治疗心血管疾病外还具有潜在抗病毒和抗炎药理活性。

2019 年12 月以来，一种由新型冠状病毒（2019-nCoV）感染引起的肺炎（COVID-19）对全球人类健康造成极大威胁，2019-nCoV 感染可能会导致心脏损伤，且具有心血管基础疾病的新冠肺炎患者预后明显较差，而新冠肺炎中医诊疗方案中对于具有心血管疾病合并症的患者缺少更为精细化的用药指导。推测GBE50 对心血管疾病合并COVID-19 具有一定的疗效，在此基础上应用网络药理学方法探究GBE50 已知活性成分治疗心血管疾病合并COVID-19 的作用及其机制，为GBE50 有效成分研究提供理论依据，同时为治疗心血管疾病合并COVID-19 提供新的用药选择。

1 材料与方法

1.1 仪器及材料 Waters Acquity UPLC/Xevo G2-XS Q-TOF超高效液相色谱质谱联用仪，Waters UNIFI 软件，Sartorius SQPQUINTIX65-1CN 分析天平，KQ-700DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Milli-Q 超纯水器（美国Millipore 公司），高速离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）。银杏酮酯片（上海上药杏灵科技药业股份有限公司），醋酸铵、甲酸、乙腈、甲醇。

1.2 GBE50 活性成分 称取银杏酮酯原料药0.1 g，置具塞离心管中，加入50%甲醇10 mL，涡旋振荡1 min，超声提取15 min，再振荡1 min，离心（6 000 r/min）10 min，分取上清液于25 mL 容量瓶中，重复上述操作1 次，合并2次上清液，用50%甲醇定容至25 mL，摇匀，进样。在含0.1%甲酸0.2 mol/L 醋酸铵溶液-乙腈质谱条件下梯度洗脱75 min，UPLC-Q-TOF/MS 分析得到银杏酮酯总离子流图。根据总离子流图所得到的化合物精确分子量、二级碎片信息，与对照品和参考文献相比对，获得全部成分信息。

1.3 关键靶点的富集 在TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、SymMap（http：//www.symmap.org/）、BATMANTCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、YaTCM（http：//cadd.pharmacy.nankai.edu.cn/yatcm/home）和SwissTargetPrediction（http：//swisstargetprediction.ch/）数据库中预测活性成分的靶点。在TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd.asp）、Drugbank（https：//www.drugbank.ca/）、HGDB（http：//www.hgdb.ir）和DisGeNET（https：//www.d-isgenet.org/）数据库中查询心血管疾病、炎症及病毒性疾病获得相关靶点。取活性成分作用靶点与疾病相关靶点交集，获得GBE50 治疗心血管疾病合并COVID-19 患者的关键靶点。

1.4 网络构建与分析 疾病-活性成分-关键靶点导入Cytoscape 3.6.0 软件，构建“疾病-活性成分-关键靶点”网络，并应用Cytoscape 软件中“Network Analyzer”功能进行网络分析，根据Degree 值筛选出重要成分。

分别将GBE50-心血管疾病、GBE50-抗炎、GBE50-抗病毒靶点及GBE50-3 种疾病合并靶点分别导入STRING（http：//string-db.org/）数据库，限定物种为人，设定置信度≥0.9，将得到的文本数据分别导入Cytoscape3.6.0 软件构建PPI 网络，应用“Network Analyzer”功能进行网络拓扑指标分析，筛选Degree 值较高的靶点，整理获得PPI关键靶点数据表。保留GBE50-3 种疾病合并靶点网络图，并应用MCODE 插件进行靶点分类。

1.5 GO 分析和KEGG 通路分析 将关键靶点导入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库，选择研究背景为人，选择生物过程（Biological Process，BP）、细胞组成（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）及KEGG 通路进行数据下载，通过Omic share（http：//omicshare.com/）进行可视化分析。

1.6 分子对接验证 从RSCB PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）下载心血管靶点AKT1、2019-nCoV 3CL 水解酶蛋白及被确定为2019-nCoV 刺突蛋白的受体［7］—ACE2 的晶体复合物。运用PyMOL 软件对靶蛋白中进行修饰，移除其中的小分子和配体，保存为pdb 格式文件。从PubChem 数据库获取关键化合物的2D 结构，应用OpenBabel 2.4.1 软件将其保存为mol 格式，最后运用Swissdock（http：//www.swissdock.ch/docking）平台对关键成分和靶点进行分子对接。

2 结果

2.1 GBE50 有效成分获取 UPLC-Q-TOF/MS 分析得到GBE50 总离子流图（图1），通过与文献及对照品比对，共鉴定出73 个化学成分，包含萜内酯、黄酮及其苷类、有机酸、黄烷醇、双黄酮5 大类。基本覆盖了GBE50 总离子流图中响应显著高于基质效应的化学成分，其中有39 种成分与对照品比对过且能在Pubchem、TCMSP 等数据库中检索到相关信息，这些成分总相对含量在73 个化学成分中占比约为75.6%，能代表GBE50 中绝大部分化学成分，体现了中药的多组分、多靶点、整体性的特点，各成分相关信息见表1。其中相对含有量占比表示各成分峰面积与73 个成分总峰面积比值。

图1 GBE50 的LC-MS/MS 图谱

2.2 关键靶点的富集 通过TCMSP 等中药数据库、SwissTargetPrediction 检索预测活性成分的相关靶点476 个。TTD等数据库获得心血管疾病相关靶点4 380 个，炎症靶点652个，病毒感染类疾病靶点807 个，成分靶点与疾病靶点取交集（图2）。获得GBE50 成分靶点中抗心血管疾病、抗炎或抗病毒的靶点共356 个，仅具有抗心血管疾病的靶点有338 个，具有抗炎靶点114 个，抗病毒作用的靶点有103个。其中CVD 表示心血管类疾病靶点、I 表示炎症靶点、V表示病毒性疾病靶点、compound 表示GBE50 成分靶点。

2.3 成分-疾病-靶点网络图的构建 将3 种疾病对应的39个活性成分与365 个靶点导入Cytoscape 3.6.0 软件中构建GBE50 治疗“疾病-成分-靶点”网络图（图3）。图3 共涉及398 个节点和1 552 条边，其中成分-靶点网络有395 个节点，997 条边。图中菱形代表黄酮及其苷类，平行四边形代表双黄酮类，八边形代表萜内酯类，六边形代表有机酸类、三角形代表黄烷醇类；倒三角形代表疾病；圆形代表关键靶点。几种疾病靶点在5 类成分中都有不同程度的分布，以黄酮类的槲皮素、芹菜素；双黄酮类红杉双黄酮、金松双黄酮；萜内酯类银杏内酯A；有机酸类咖啡酸；黄烷醇类没食子儿茶素等靶点较多，为GBE50 发挥作用的关键性成分。

表1 GBE50 成分信息数据

图2 成分靶点与疾病靶点韦恩图

2.4 PPI 网络的构建分析 分别将GBE50-炎症114 个靶点、GBE50-病毒性疾病103 个靶点，GBE50-心血管疾病338 个靶点及，GBE50-3 种疾病的356 个靶点导入STRING数据库，限定物种为人，设定置信度≥0.9，数据导入Cytoscape 软件构建PPI 网络图及关键靶点信息，保留治疗3种疾病的PPI 网络图（图4）。应用MCODE 插件进行靶点分析，筛选出K-Core 较大的3 组子网络图（图5～7）。图3中共涉及313 个节点和1 809 条边，图中节点越大颜色越浅代表靶点的度值越高，相反颜色越深节点越小代表度值越低，并以该图对应靶点按度值由大到小进行排序，且列出对应的部分靶点在其他网络图中度值，其中T 列代表3 种疾病，CVD 代表心血管疾病，V 代表病毒性疾病，I 代表炎症。结合图5～7GBE50 发挥作用可能与AKT1、VEGFA、IL-6、TNF 等关键靶点有关。

2.5 KEGG 通路分析 DAVID 数据库获得GO 分析中BP组652 条（P＜0.05），CC 组73 条（P＜0.05）、MF 组164条（P＜0.05）、146 条KEGG 信号通路（P＜0.05），分别以P值从小到大对BP 组和KEGG 信号通路结果进行可视化分析。结果表示GBE50 可能参与药物反应、氧化还原过程、炎症反应等多条生物过程，乙型肝炎（Hepatitis B）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Aktsignaling pathway）、非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer）、小细胞肺癌（Small cell lung cancer）等多条信号通路发挥治疗心血管肺炎合并新冠肺炎患者的作用。

图3 疾病-成分-靶点相互作用网络图

图4 心血管疾病合并COVID-19PPI 网络图

表2 成分-疾病靶点对应数据表

图5 K-Core 值较高的部分PPI 子网络

图6

图7

表3 关键靶点及其度值

2.6 分子对接 在5 类成分中选取较关键的成分与关键靶点AKT1、2019-nCoV 3CL 及ACE2 进行分子对接验证，通过Swissdock 数据库获得的分子对接结果如表4 所示，一般认为分子与靶点分子对接的结合能低于0 时分子与配体能够有效结合，当结合能≤7.0 kJ/mol 时，分子与靶点结合较紧密，其中金松双黄酮与AKT1、3CLpro、山柰酚与ACE2 等结合能较低。

图8 GBE50 有效靶点生物过程图和通路分析图

图9 关键成分-靶点分子对接图

表4 部分活性成分与关键靶点分子对接数据表

3 讨论

GBE50 有活血通络、益智开窍的功效，与普通银杏叶提取物相比，GBE50 的成分更为明确，其萜类内酯含有量在6%以上，黄酮在44%以上，其中黄酮醇苷24%、游离黄酮20%，游离黄酮的生物利用度是黄酮醇苷的7 倍。通过“双重吸附、双重去除”银杏酸，使其含有量不高于1 PPM。以GBE50 为代表的第五代银杏叶制剂的特点为药效成分含有量高，生物利用度好，毒性物质含量极低。其疗效优于一般的银杏叶制剂，在治疗时可作为银杏叶制剂的首选。

3.1 GBE50 活性成分与关键靶点 成分信息数据表中以槲皮素，山柰酚为苷元的苷相对含有量占比较大，而口服给药后苷多水解成苷元形式被吸收，因此GBE50 给药后体内槲皮素，山柰酚等苷元相对增高［8］。网络药理学结果显示槲皮素、芹菜素、山柰酚等黄酮类成分可作用于AKT1 等关键靶点发挥抗炎抗病毒作用，通过基于假病毒的药物筛选系统抑制H5N1 病毒的进入，可在流感病毒感染早期抑制其活性，其中槲皮素、山柰酚等成分已被证明可能是治疗COVID-19 的关键性成分［9-11］。银杏双黄酮是GBE50 中的又一类关键成分，数据表明6 种双黄酮成分均可作用于VEGFA，VEGFA［12］活跃于血管新生、生长和内皮细胞生长，药物［13］可通过PI3K/Akt 信号通路激活VEGFA 启动子，诱导VEGFAmRNA 的转录表达，促进血管形成，改善心肌梗死，从而保护心脏血管。银杏双黄酮还能够抑制炎性因子，如IL-6 等，发挥抗炎作用，如通过减少由HNE 导致的A549 细胞中黏液蛋白5AC基因表达和抑制HNE 处理A549 细胞后p38 与AKT 通路的磷酸化，而抑制IL-8 mRNA的表达，从而减轻肺部炎症细胞浸润，达到抑制气道炎症的效果［14］。

白果内酯、银杏内酯A、B、C、J 等是银杏的特有成分，且在GBE50 相对含有量占比较高［15］，其中4 种成分均作用于ABCB1 靶点，研究证明ABCB1 不同基因形态能够影响心血管药物在体内的吸收，它决定心血管药物体内的利用程度，银杏内酯A 能够增加心肌细胞存活率及其收缩幅度，降低Bax 与Bcl-2 的比值等减少心肌细胞的凋亡，银杏内酯B 对脂多糖诱导的人肺泡上皮细胞炎症反应有保护作用［16-17］。因此萜内酯类成分也是GBE50 中发挥抗心血管疾病的关键成分，兼有抗肺部炎症的作用。有机酸中咖啡酸的有效靶点数目较多，具有保护和预防心血管疾病的作用，同时具有抗氧化活性，通过抑制5-脂氧合等发挥抗炎作用［18］，另外细胞实验结果［19］显示咖啡酸还能抑制由蜂毒肽和花生四烯酸刺激引发的组胺释放，从而证明咖啡酸有抗病毒的作用。最后黄烷醇类成分中的没食子儿茶素［20］也可通过影响HIV 的复制过程，起到抑制HIV 病毒的作用。综合GBE50 中有效成分与关键靶点的分析，验证了GBE50 可通过不同的成分及靶点同时能发挥抗心血管疾病，抗炎症及抗病毒的作用。

3.2 GBE50 治疗合并心血管疾病的COVID-19 重要信号通路 KEGG 通路分析中乙型肝炎、PI3K/Akt 信号通路等是GBE50 治疗合并心血管疾病的COVID-19 关键信号通路，如任宇超等［21］发现药物能够通过调节PI3K/Akt 信号通路抑制冠心病大鼠心肌细胞凋亡，该结果与清肺口服液治疗病毒性肺炎的关键通路相同，推测GBE50 也可能是通过这些通路起到潜在保护COVID-19 患者的作用［22］。PI3K-Ak信号通路的AKT1 蛋白、COVID-19 的关键蛋白2019-nCoV 3CL 水解酶和ACE2 与GBE50 活性成分分子对接验证了GBE50 不仅具有治疗心血管疾病作用，还具有防治COVID-19 作用。

本文应用网络药理学方法综合成分、靶点、通路的数据分析证明了GBE50 通过多成分多靶点发挥治疗心血管疾病和抗新冠肺炎的作用，心血管疾病对感染新冠病毒的患者有较大的安全隐患，而GBE50 不仅是治疗心血管疾病的良药，且有抗COVID-19 的潜在作用，临床运用GBE50 治疗具有心血管基础疾病的新冠肺炎患者，改善其预后，同时为这一时期患者提供可靠的用药选择。