基于星点设计-效应面法优化的紫薯花青素胃漂浮缓释片的制备及评价标准

白明勇，周钥，姜雪冰，程忠，吴逸凡，杨洪致，陈秋红

(成都理工大学，成都 610051)

花青素是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属于黄酮类化合物，也是植物花瓣中主要的呈色物质。紫薯花青素作为一种天然食用色素，具有产量高，成本低，营养丰富，耐光性和耐热性好等优点。大量研究表明，紫薯花青素具有降低血脂和抗氧化[1-2]，保护肝脏[3]，抗炎症[4]，预防肥胖[5]，抑制金黄色葡萄球菌[6]和介导肝癌细胞SNU-387和结肠癌HCT－116细胞凋亡过程的抗癌等作用[7-10]。紫薯花青素在酸性环境下稳定，中性、碱性环境中易分解失效的理化性质使得紫薯花青素口服给药后，在胃部稳定，转运至肠道后，受到肠道中性环境的影响分解失效，较大地影响了其口服生物利用度，因此增加紫薯花青素在胃部的滞留时间以提高其口服生物利用度的新型制剂研究迫在眉睫；胃漂浮缓释片可以使药物一直处于胃部酸性环境中，同时减少给药次数，提高紫薯花青素稳定性的同时提高了患者服药的顺应性。近年来，李飞[11]和王余梦[12]等研究了紫薯花青素微胶囊工艺，未见紫薯花青素胃漂浮缓释片的文献报道。本实验以紫薯花青素为模型药物，以羟丙甲基纤维素(HPMC)为主要辅材，采用湿法制粒压片的方法制备胃漂浮缓释片，减小生理环境对药物稳定性的影响，延长花青素在胃内的滞留时间，以达到提高紫薯花青素口服生物利用度，减少给药次数的目的。

1 材料与仪器

1.1 仪器

紫外-可见分光光度计(上海谱元仪器有限公司)；万分之一电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；TDP-6单冲压片机(吉首市中诚制药机械有限公司)；ZRS-8G智能药物溶出仪(天津市精拓仪器科技有限公司)。

1.2 试剂

花青素原料药(西安优硕生物科技有限公司，批号：YS20180618)；羟丙甲基纤维素(HPMC K4M，Ashland)；乳糖(成都科龙化工试剂厂)；共聚维酮(上海昌为医药辅料技术有限公司)；碳酸氢钠、硬脂酸镁均为药用规格；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 体外释放度测定

2.1.1 标准曲线建立

精密称取紫薯花青素提取物，以0.1mol/L盐酸为溶剂，制备成浓度为6、12、30、60、100μg/mL的系列对照品溶液，于525nm波长处测定吸光度[13]，将吸光度值(A)对浓度(c)进行线性回归，得回归方程为 A=0.0015c－0.00452；r2=0.99997(见图1)。结果表明，紫薯花青素在 6～100μg/mL浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.2 方法学考察

加样回收实验：取精密称定后的紫薯花青素原料药，以pH=1盐酸溶液为溶剂，配制低(20μg/mL)、中(40μg/mL)、高(80μg/mL)浓度的紫薯花青素溶液，连续6次在525nm处测定吸光度，结果表明该法回收率良好(见表1)。

方法学考察表明，其精密度、重复性与稳定性实验相对标准偏差(RSD)均符合相关要求。说明建立的分析方法可用于紫薯花青素的含量测定。

2.1.3 37℃(释放实验温度)紫薯花青素的稳定性实验

按加样回收项下方法分别配置浓度为20μg/mL、40μg/mL、76μg/mL的紫薯花青素盐酸溶液，在37±0.5℃保温11h，定时取样3mL，在525nm处测定吸收，根据标准曲线方程A=0.0015c－0.00452计算样品浓度，结果见表2由结果可知，紫薯花青素盐酸溶液在释放试验条件下11h内稳定。

2.1.4 释放度测定方法

按《中华人民共和国药典》2015年版(四部) 通则0931第一法(篮法)操作，以900mL的0.1mol/L盐酸为释放介质，转速为100r/min，温度(37.0±0.5)℃。在各规定测定时间取样5mL(随后补加同温度下等体积介质)，0.45μm滤膜过滤，取续滤液于525nm处测定吸光度，计算累积释放度。

图1 紫薯花青素的标准曲线

2.2 制剂处方优化

2.2.1 紫薯花青素胃漂浮缓释片的制备

该缓释片采用湿法制粒压片，具体制备方法为：按处方量称取主药与辅料，加入乳糖，混匀，以95%乙醇为润湿剂，用24目药典筛制粒，50℃干燥后整粒，加入润滑剂硬脂酸镁1%，混匀5min；压片，得硬度(50±2)N，片重约300mg紫薯花青素胃漂浮缓释片，每片含紫薯花青素30mg。

2.2.2 试验设计

预试验和单因素试验考察结果显示，制剂处方中HPMC K4M、共聚维酮与碳酸氢钠的用量为药物释放和片剂漂浮性能的主要影响因素。各制剂处方胃漂浮性能良好，释药性能差别较大，选取制剂在1h、4h、8h的累积释放度Q1h(20%～35%)、Q4h(40%～60%)、Q8h(85%～95%)为评价标准。星点设计-效应面法是近年来常用的实验设计和优化方法，具有实验精度高、拟合性好等特点[14]，按照星点设计－效应面法优化的原理设计了三因素五水平试验，具体水平设置见表3，试验安排及结果见表4。

2.2.3 紫薯花青素胃漂浮片漂浮性能

漂浮性能的测定采用直接观察法。配制浓度为0.1mol/L的盐酸900mL于溶出仪中，将制备好的片剂沿溶出杯同一高度划入溶液表面，启动搅拌桨(100 r/min)模拟胃蠕动温度37℃，记录起漂时间和持漂时间。从星点设计的结果来看，除处方1、3、8、9外，其余处方均迅速起漂，持漂时间均＞8h。

2.2.4 模型拟合实验

应用 Design Expert 8.0.6.1 版软件，分别进行多元线性回归拟合和二元多项式拟合[15]。以置信度(P＜0.05)作为显著标准，剔除不显著项后选取复相关系数(r2)较大的模型，对其进行优化。

多元线性方程：

表1 紫薯花青素加样回收实验结果

表2 样品溶液释放度条件下的稳定性(n=5)

二项式拟合方程:

表3 星点设计因素水平表

表4 试验安排及结果

比较多元线性拟合方程和二项式拟合方程的复相关系数，根据显著性(P＜0.05)和r2最大原则，优选出二项式方程拟合效果更佳。经简化后模型方程P＜0.05，r2＞0.7109，方程具有较高的可信度。星点设计-效应面法的拟合方程及方差分析表明，处方中HPMC K4M与共聚维酮用量对药物释放有极显著影响，碳酸氢钠用量对药物释放的影响不显著,药片主要由于碳酸氢钠与胃内酸性介质反应持续产生气体而快速且持续漂浮在胃内，实验得出碳酸氢钠的用量是影响漂浮性能的主要因素。

2.2.5 效应面

根据简化后的二项式拟合方程，分别以累积释放度Q1h、Q4h、Q8h对A(HPMC)，B(碳酸氢钠)，C(共聚维酮)做三维效应面图和等高线图(见图2)。从三维效应面图和等高线图可看出，药物累积释放度随 HPMC K4M和共聚维酮用量的增加而降低，共聚维酮用量对药物释放的影响比HPMC K4M用量更显著，三因素中对本制剂体外释药影响大小为共聚维酮＞HPMC＞碳酸氢钠。

2.2.6 优化处方

经模型拟合，将效应面对应的等高线叠加，得到辅料用量预测最佳范围为:HPMC 17.46%～26.94%、碳酸氢钠9.62%～15.13%。优化处方的等高线叠加图(图3)。根据 Design-Expert软件优选出最佳处方:HPMC 19.08%、碳酸氢钠14.34%、共聚维酮7.12%。

图2 Q1h、Q4h、Q8h 对HPMC和共聚维酮的三维效应面图和等高线图

2.2.7 释放度测定

按照最佳处方：HPMC 19.08%、碳酸氢钠14.34%、共聚维酮7.12%，平行制备三批紫薯花青素胃漂浮缓释片，每批投药量为6片，所制备的胃漂浮缓释片的起漂时间＜5min，续漂时间＞11h，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11h的累积释放度RSD分别为0.86%、4.11%、7.34%、1.39%、3.39%、1.64%、2.67%、0.76%、0.55%、1.18%、1.10%各批次取样点平均累计释放度和RSD值见表5，重复性良好，符合设计要求。其中1h，4h，8h累积释放度的预测值和实测值见表6，预测值和实测值偏差绝对值均小于5%，表明实验所得拟合方程能很好的预测实验结果和趋势。

2.2.8 释药机理初步研究

图3 处方优化等高线叠加图

表5 各批次取样点平均累计释放度和RSD值(n=6)

按最佳制剂处方制备紫薯花青素胃漂浮缓释片，三批样品体外释放曲线见图4。应用Origin 2016软件对其体外释放曲线进行方程拟合，分别采用了零级动力学方程、一级动力学方程、Higuchi方程、Weibull方程和Ritger-peppas方程等进行拟合，拟合结果见表7。其体外释放行为，以Weibull方程拟合效果最好，Weibull拟合曲线见表5。拟合方程结果可以看出药物为非 Fick 扩散，通过扩散和骨架溶蚀共同作用释药[16]。在释放试验中，HPMC吸水形成凝胶，药片体积逐渐增大，药物透过凝胶骨架空隙缓慢扩散，释药后期以骨架溶蚀为主，同时可以得出药物释放符合一级速率过程，释放曲线具有明显的缓释特征。体外释放度试验显示，制备的紫薯花青素胃漂浮缓释片达到11h缓释。

3 讨论与展望

普通片剂在胃肠道滞留时间太短，未被释放就通过吸收部位，胃漂浮片是根据流体动力学平衡原理制成的一种新型制剂，这种制剂在胃中滞留时间长，将紫薯花青素制成胃漂浮缓释片有助于提高紫薯花青素的口服生物利用度。

不同黏度的HPMC 对药物释放度影响较大，在实验前期考察了不同黏度的HPMC(K4M、K15M)对药物体外释放度的影响，实验结果显示HPMC K15M黏度过大，药物释放过于缓慢，黏度较低的HPMC K4M更符合本实验对胃漂浮缓释片的要求，因此本实验选择了HPMC K4M为凝胶骨架。

根据星点设计试验处方1、3、9结果，可以认为凝胶骨架HPMC的用量对于药物突释有较大影响，用量过少会导致药物突释；根据处方15，16结果，可以认为共聚维酮对药物释放同样有较大影响，过多会造成药物释放过缓，过少会造成药物突释。

表6 验证处方的累积释放度

图4 优化处方的体外释放曲线(n=6)

本实验为胃漂浮缓释片应用于更多种类的花青素的实际应用提供了指导，但因时间有限，本实验仅对紫薯花青素胃漂浮缓释片体外释放度进行了研究，而未对紫薯花青素胃漂浮缓释片进行体内漂浮性能及释药特性进行研究，在将来的研究中将更全面的研究其漂浮性能和释药特性。

药物稳定性是保障药物安全性和有效性的基本条件，本实验还未对紫薯花青素胃漂浮缓释片进行影响因素、加速实验以及长期稳定性方面的实验，后续应考察该制剂在温度、湿度以及光照的影响下随时间变化的规律，为药品的生产、包装、贮存及运输条件提供科学依据。

表7 最佳处方体外释放度拟合方程

图5 Weibull拟合曲线

本文通过星点设计-效应面法设计安排试验并对结果进行拟合分析，建立了共聚维酮、HPMC K4M和碳酸氢钠用量与胃漂浮缓释片释药特性的二次模型，得到最佳处方:HPMC 19.08%、碳酸氢钠14.34%、共聚维酮7.12%、乳糖 49.46%,整粒后加入硬脂酸镁1%，经试验验证，最优处方制得胃漂浮缓释片持漂时间＞11h，11h累积释放度达到95%以上，具有良好的漂浮性能，制备方法简便，工艺稳定。星点设计-效应面法可以很好的用于紫薯花青素胃漂浮缓释片处方工艺优化，具有很好的应用价值。