低产乙醛拉格啤酒酵母的选育

孙传伯，曹 猛，陈存武，赵 群

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237000；2.海南大学 化学工程与技术学院，海南 海口 570228)

拉格啤酒(Lager Beer，名字来源于德语：Lagern，意为窖藏)，又称窖藏啤酒，是一种利用低温熟成技术制作的啤酒。采用桶底发酵的酵母菌发酵而成。在现在的市场上，啤酒的品牌多，市场需求量大，各种品牌都有其特色作为卖点，然而很多啤酒在其风味物质控制方面做得不够。不管是哪一种啤酒，因其原料所含有的营养物质很丰富，在发酵过程中被微生物分解，生成很多产物，其中有多种风味物质，比如醛类、高级醇、高级酯等，它们对啤酒的风味影响差别也很大，尤其是乙醛造成的影响较大。除此外，根据一些研究报道指出乙醛对人体有一定的危害，产生不良反应，包括使人产生恶心、呕吐等[1]。如果我们能够将啤酒中乙醛的含量控制下来，对其的风味和其对人健康的影响的变化都是很大的。从目前发表的文章等可以发现，通过改进生产工艺的方法来降低产生的乙醛含量的方法很多[2]，也有人利用分子生物学的技术处理菌株[3]，此外，还有利用超高压进行诱变的方法等[4-5]。本实验是在紫外诱变技术的基础上，通过一系列筛选方法确定一种筛选产乙醛低的酵母的方法，以便用于拉格的工业化生产中，做到以此方法筛选的菌株进行发酵生产获得高品质拉格啤酒，同时，产生较大的经济方面的效益。

1 材料和方法

1.1 仪器设备

见表1。

1.2 材料和试剂

见表2。

1.3 实验方法

1.3.1 麦芽汁培养基的制备

用粉碎机将麦芽粉碎，称取粉碎物，以1∶4(麦芽:水)的比例加入足量的水，在65 ℃水浴锅中加热2 h，取出进行首次过滤后，对滤液煮沸15 min后，进行再次过滤，用糖度计测其糖度，并加水调整糖度值为10后，进行灭菌(121 ℃，20 min)，对灭菌后的培养基进行再一次的过滤灭菌。

表1 实验中使用仪器设备

表2 实验材料与试剂

1.3.2 酵母的活化

向200mL无菌水中加入无菌条件下取的斜面试管酵母(编号L33)，置于摇床上进行活化处理。吸取少量活化后的酵母悬液进行平板涂布，放于培养箱中培养(28 ℃，48～72 h)。选择培养后长势较好的单菌落作为出发菌株1，进行斜面保藏。

1.3.3 筛选方法

方法一(希夫组)：在麦芽汁平板上涂布出发菌株1，紫外诱变后，经新配制的希夫试剂筛选后进行高效液相色谱分析；

方法二(甲吡唑组)：在添加有甲吡唑的麦芽汁培养基上涂布出发菌株1，紫外诱变后，经新配制的希夫试剂筛选后进行高效液相色谱分析；

方法三(乙醛组)：在麦芽汁培养基上涂布出发菌株1，紫外诱变后，先经希夫试剂筛选后，再在添加有乙醛的培养基上进行涂布筛选，最后再通过高效液相色谱进行分析。

1.3.4 紫外诱变条件的优化

超净工作台的紫外灯的功率为20 W，实验中以菌株与紫外灯的距离以及菌株被紫外灯照射的时间为变量。其中距离分别为18 cm、24 cm、30 cm，照射时间分别为0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s，共21组，每组三个平行[6]。把涂布有酵母菌的麦芽汁培养基平板置于上述条件下进行紫外诱变处理。选出后续实验关于紫外诱变处理的最优条件。

1.3.5 希夫试剂的配方优化

方法一：详细方法详见参考文献[7]，文献方法中的蒸馏水替换为去离子水。

方法二：详细方法详见参考文献[8]。

1.3.6 甲吡唑培养基浓度的优化

配制甲吡唑溶液并密封保存于4 ℃条件下。将1 g/L浓度的甲吡唑溶液用无菌注射器在0.2 μm无菌膜下过滤。分别吸取一定量配制成甲吡唑浓度为0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、650 mg/L、700 mg/L、750 mg/L、800 mg/L、850 mg/L、900 mg/L，每组平板做三个平行。确定后续实验中甲吡唑培养基中甲吡唑的最佳浓度[8]。

1.3.7 乙醛培养基浓度的优化

从经过紫外诱变后筛选得到的酵母菌种中选择任意的一种，用于做乙醛培养基中乙醛浓度的优化。取适量经过稀释后的乙醛加入培养基中，从而使得乙醛的终浓度分别为0 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L、2.5 mg/L、3 mg/L、3.5 mg/L、4 mg/L、4.5 mg/L、5 mg/L。每组做三个平行平板，根据平板上酵母菌的存活率来确定出乙醛培养基中乙醛的最佳浓度[9]。

1.3.8 三角瓶发酵实验

对所有筛选出的斜面保藏的菌株进行三角瓶发酵实验：从装有100 mL无菌水的三角瓶中取少量水加入到试管斜面，用接种环将斜面上的菌刮下来后，然后将其加入到前面装有无菌水的三角瓶中，然后进行适度稀释，再向装有100 mL麦芽汁的三角瓶中分别加入1 mL菌液(107个/ML)，每支试管样至少做3～5个三角瓶，放于培养箱中培养。

1.3.9 液相色谱条件的优化

流动相中乙腈与水体积比为3∶1，柱温为30 ℃，检测器为二极管阵列检测器，将其分析运行时间分别设置为5 min、10 min，流速分别设置为0.1 mL/min、0.2 mL/min、1.0 mL/min，进样量为10.0 μL，检测波长360 nm[10]，在此基础上进行液相条件的优化[11]。

精确取2,4-二硝基苯肼0.0500 g，用乙腈进行定容配制成浓度为50 mg/L的溶液，并经过孔径0.45 μm的有机系微孔滤膜过滤处理。同时将接种酵母后的得到的发酵液经过孔径为0.45 μm的水系微孔滤膜过滤处理。按照体积比分别为1∶1、1∶2、1∶5、2∶1、5∶1取发酵液与2,4-二硝基苯肼溶液进行混合，静止30 min后进行测定[12]。

1.3.10 液相色谱测发酵液中的乙醛含量

因为乙醛与2,4-二硝基苯肼两种物质混合后会反应产生乙醛-2,4-二硝基苯腙，利用液相色谱，通过外标法测定反应产物的含量再通过反应关系换算求得乙醛含量。称取0.0052 g乙醛-2,4-二硝基苯腙的标准品，并用乙腈定容至50 mL，分别从中取0 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2.5 mL定容至50 mL，配制成标准待测溶液，按照液相色谱的优化条件进行标准曲线的测定。以配制的标准品乙醛-2,4-二硝基苯腙的浓度为横坐标，以色谱图中的峰面积为纵坐标，制作关于标准品的标准曲线，以便后续定量分析的需要[13-16]。

发酵液乙醛含量测定：取前面提到的经过处理的发酵液用于液相色谱测定。根据标准曲线方程，由峰面积计算出样品中反应产物乙醛-2,4-二硝基苯腙的浓度，从而计算出发酵液中乙醛含量。根据所有发酵液测出来的值，经过换算后得出各菌株发酵液中乙醛含量。对各组发酵液进行乙醛降幅和平均降幅的计算[9]。

1.3.11 方法稳定性实验

重新选取一株酵母菌作为出发菌株2(编号L37)，通过前面选出的最优方法对其进行处理后筛选的菌株作为原代，同时进行传代实验，连续培养至第5代，对每代菌都进行发酵实验，按照同样的液相色谱条件进行测量分析[17]，验证筛选方法的稳定性。对出发菌株2及经过筛选方法后得到的出发菌株2原代进行镜鉴比较，观察其的形态差别。

2 结果与分析

2.1 紫外诱变最优条件

图1 希夫试剂配方比较(左为方法一，右为方法二)

从表3中可以看出，随着照射时间以及光源距离的缩短，菌株的存活率逐渐降低，相对于照射距离，照射时间对酵母菌的存活率影响更大，尤其是在照射30 s～45 s的范围，酵母的存活率大大降低，基本是由70%降到20%。当照射时间为90 s时，存活率就变得很低。考虑到实验需要选择一定量的菌株，所以本实验采用菌株存活率在20%左右的筛选条件，因此紫外诱变的最优条件是45 s，24 cm。

表3 紫外诱变条件的优化结果

2.2 希夫试剂配方的优化

按照希夫试剂的两种方法进行配制，对菌株进行筛选，发现使用方法一配制的希夫试剂染色效果较好，且不会造成菌落被冲散的现象，不同菌落颜色变化差别明显；使用方法二配制的希夫试剂染色过浅，不同菌落染色出现的差别不明显，同时菌落很容易就被冲散，出现呈类似于固体被溶解的现象。

2.3 甲吡唑培养基中甲吡唑浓度的优化

表4 甲吡唑浓度的优化

在实验进行过程中，起初配制的培养基中含有的甲吡唑浓度在0～600 mg/L范围内，但是由于菌株死亡率不高(未进行详细的记录)，所以将其浓度继续增大。本实验的思路是，将菌株涂布在含有甲吡唑的培养基不进行诱变，根据实验结果确定菌株存活率为0时的甲吡唑浓度，再将菌株涂布在此浓度的甲吡唑培养基上并进行紫外诱变，此时平板上长出的菌即为突变后的菌株，再用希夫试剂进行进一步的筛选。而从表5中可以看到，当甲吡唑培养基中的甲吡唑浓度为900 mg/L时，酵母菌的存活率为0，所以最优的甲吡唑浓度为900 mg/L。

2.4 乙醛培养基中乙醛浓度的优化

根据实验条件测得的酵母菌的存活率如表5。

表5 乙醛浓度的优化

由表5中的数据可以看出，随着培养基中乙醛含量的升高，酵母菌的存活率越来越低，总的来看，存活率降低的速度比较稳定。因为此环节是在紫外诱变后并且已经被希夫试剂筛选过的菌株的基础上进行的，而后面将菌株涂布在含有乙醛的培养基上需要有一定的存活率才能保证后续实验的进行，所以此环节考虑采用菌株存活率为20%左右的筛选条件，由表6知，所选取的乙醛培养基中乙醛的最佳浓度为5.5 mg/L。

2.5 液相色谱测发酵液中的乙醛含量

高效液相色谱测定中，流动相中乙腈与水的体积比为3∶1，流速为1.0 mL/min，对所进样品的分析运行时间为5 min，每次所进样的量为10.0 μL，柱温为30 ℃，检测器为二极管阵列检测器，检测波长为360 nm。

将经过孔径为0.45 μm的水系微孔滤膜过滤的发酵液，与经过孔径为0.45 μm的有机系微孔滤膜过滤的2,4-二硝基苯肼，按照体积比为2∶1的比例加入反应管，静置30 min后再进行测定的前处理方法相对较好。

根据前面得到的优化后的液相色谱的优化条件分析标准品，所得谱图如下图2：

图2 样品发酵液液相色谱图

由配制的标准溶液测得的值如下表6：

表6 标准溶液的测定

由表6中数据，以标准品的浓度为横坐标，以其峰面积为纵坐标，绘制的标准品的标准曲线的方程为：y=60.361x-1.3722，R2为0.9999，由此可以看出线性相关程度较好。

根据最优液相色谱条件测得的发酵液中乙醛浓度如表7、表8和表9所示。

表7 发酵液中乙醛浓度的测定(希夫组)

表8 发酵液中乙醛浓度的测定(甲吡唑组)

表9 发酵液中乙醛浓度的测定(乙醛组)

由表7、表8和表9中的数据计算可得，方法一的正突变菌株在所在希夫组占比为54.55%，平均降幅为17.49%，方法二的正突变菌株在所在甲吡唑组占比为25%，平均降幅为18.10%，方法三的正突变菌株在所在乙醛组占比为72.73%，平均降幅为26.12%。从突变方向来看，方法三的正突变率最高，而方法二的正突变率最低，此组内大部分都为负突变菌株且其的乙醛增幅较大。从乙醛降幅上来看，方法一的平均降幅最小，而同样是方法三的平均降幅最大。综合这两点，方法三的效果最好，此法能够在高的正突变率的前提下，获得产乙醛低的菌株。

2.6 方法稳定性实验

表10 方法稳定性实验

图3 出发菌株2(左)及原代(右)镜检图

为保证稳定性实验结果的可对比性，除了测定从出发菌株2原代到第5代的菌株发酵液外，同时测定出发菌株2的发酵液，从表10中可以发现，各代菌株产生的乙醛含量都低于原菌发酵液中的乙醛量，相对于出发菌2，出发菌株2原代至第5代产生的乙醛降幅为9.32%、8.56%、7.16%、7.92%、7.22%、6.46%，虽然随着代数的增加产生的乙醛含量呈现出较小的增加的现象，但是乙醛降幅基本保持在7%左右，从实验结果来看，方法三的这种筛选方法具有一定的稳定性。对出发菌株2和经方法三筛选后的原代进行镜鉴，未见其有任何明显的形态差异，由此也可初步认为方法三对菌株的影响表现在菌株内部或者代谢调节等其他方面。

出发菌株2及经筛选后的原代镜检的结果如图3所示，出发菌株2原代的平板如图4所示。

图4 出发菌株2原代平板

3 结论与讨论

3.1 结论与创新点

3.1.1 结论

实验中的出发菌株1和2的发酵液中乙醛的含量均小于2.0 mg/L，达到优质啤酒的乙醛含量要求(≤8.0 mg/L)。本实验通过三种方法进行菌株的筛选，每种方法都有一定的筛选效果。其中方法三降低菌株产乙醛的量的效果最好，出发菌株1的正突变率达到72.73%，乙醛平均降幅达到26.12%，且此方法具有一定的稳定性，可以应用于工业化生产中。

3.1.2 创新点

1)实验中方法三将紫外诱变、希夫试剂初筛与乙醛培养基二次筛选和高效液相色谱定量测定综合起来，对出发菌株进行多次的连续筛选，能够进一步降低菌株产生乙醛的量，此法在目前的研究中还未见有报道。

2)本实验中使用的出发菌株是从啤酒生产工厂获得，是对生产菌株的优化，是进一步的改进。目前的研究中，大都是对实验室保存的而未投入生产中的菌株的优化。实验中的菌株，其发酵液中乙醛含量降低幅度虽然不大，但是实验是在出发菌株的发酵液本身乙醛含量(<2.0 mg/L)就比较低的基础上，再进一步降低其含量的，而其他研究中所用到的出发菌发酵液中的乙醛含量比较高(3.0～10.0 mg/L)。由此也能看出，实验中方法三的筛选效果好。由产乙醛量降低这点也可以考虑适当调整企业工厂的啤酒发酵时间，在原有的基础上进一步缩短，从而降低能源的消耗，增加企业的收益。

3.2 讨论

本实验在进行液相色谱测定前的样品前处理时，没有对乙醛与2,4-二硝基苯肼反应的时间进行优化。进一步的实验可以对反应时间进行优化，找到最佳的反应时间长度。同时接下来可以对接种菌株的三角瓶的培养时间进行优化[18]，在保证啤酒品质的基础上，进一步为企业生产增加收益。实验中虽然从三种方法中筛选出一株产乙醛量最低的菌株并进行了斜面保存，但是由于时间的因素，没有对其进行进一步的菌株稳定性实验，下一步可以考虑对其进行稳定性实验。

本实验是利用高效液相色谱仪进行样品的定量分析测定的方法，它相对于一般的方法具有高效灵敏的优点。然而相对气质联用分析来讲，气质联用既体现了色谱法的高分离能力，又体现了质谱法的高鉴别能力，比高效液相色谱更适合乙醛含量的测定分析。本实验起初考虑使用气质联用仪，但是由于仪器处于被占用状态以及考虑到时间因素，没能顺利进行，进一步的实验可以考虑通过气质联用进行分析。