孤独症谱系障碍外周血潜在生物标志物的研究进展＊

周伊敏，姜志梅

孤独症谱系障碍 （autism spectrum disorder，ASD） 是一组发生于儿童发育早期的发育障碍性疾病，以社交障碍、限制性重复刻板行为和兴趣狭窄为核心症状［1］。美国疾病控制与预防中心于2020 年公布的 ASD 患病率由 1/59 增加至 1/54，中国 0～6 岁ASD 儿童患病率为 3.51‰，均呈逐年上升趋势［2，3］。迄今ASD 病因与发病机制尚未阐明，常伴有的感知觉、胃肠道和睡眠等问题已严重影响了儿童的日常生活，导致 ASD 成为严峻的社会问题之一［4］。由于儿童早期的神经系统可塑性强，研究者认为早期识别、及时诊断以及有效干预能明显改善ASD 的不良预后［5］。然而现在大多是结合儿童的核心症状、典型行为以及量表对ASD 进行诊断，主观性强，早期诊断难以实现［6］。故寻找和开发能客观有效地预测ASD 危险因素或筛查可疑ASD 儿童的生物标志物，已成为ASD 领域的研究热点。近年ASD 的外周血潜在生物标志物的研究取得较大进展，尤其在MicroRNA、lncRNA、细胞外信号调节激酶、淀粉样前体蛋白以及免疫活性物质方面。该文就ASD 外周血潜在生物标志物的研究进展进行综述，以期为ASD 的病理机制研究、早期诊断及开发药物治疗新靶点提供帮助。

1 ASD 与非编码RNA

1.1 MicroRNA微小 RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约20～24 个核苷酸的非编码单链RNA分子，由内源基因进行编码并参与基因转录后的表达。相关研究表明尸检脑组织、外周血和唾液中miRNA 表达的失调与 ASD 有关［7］。一项针对脑部尸检标本miRNA 表达水平的高通量分析表明，与正常人对比，hsa-miR-21-3p 在ASD 中被上调，能够靶向调节ASD 相关的神经元基因并下调其表达；hsa_can_1002-m 在 ASD 中被下调，能够调节涉及神经发育和免疫功能的表皮生长因子受体和成纤维细胞生长因子受体的信号通路［8］。Nt 等［9］采用定量反转录聚合酶链反应 （quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）对 30 例 3～11 岁 ASD 患者与 30 名健康对照组的血清miR-328-3p 和miR-3135a 表达水平进行检测，结果显示： 与健康对照组相比，ASD 患者中的miR-328-3p 和 miR-3135a 明显下调； 血清 miR-3135a 和miR-328-3p 可将ASD 患者与健康对照组区分开，有望成为诊断ASD 的新型生物标志物。Kichukova 等［10］对 ASD 患者与健康对照组血清中的42 种 miRNA 进行了 qRT-PCR 分析，发现 ASD 患者血清中的 3 种 miRNA （miR-365a-3p、miR-619-5p 和miR-664a-3p） 表达水平显著高于对照组，血清中的 5 种 miRNA（miR-3135a、miR-328-3p、miR-197-5p、miR-500a-5p 和 miR-424-5p）表达水平显著低于对照组，提出这8 种血清miRNA 可作为诊断 ASD 的潜在生物标志物。Nakata 等［11］采用 qRTPCR 方法检测高功能 ASD （High Functioning Autism Spectrum Disorder，HFASD） 成人患者的血液miRNA 表达水平，结果与正常组相比，miR-6126在ASD 患者中下调显著，且miR-6126 表达水平与ASD 的症状严重程度有关，但与智商（Intelligence Quotient，IQ） 无关，提示血液 miRNA 可能是诊断HFASD 的潜在生化指标。还有研究通过高通量测序技术（High-throughput sequencing）证明，血清miRNA表达水平可用作筛选和检测ASD 患者自身免疫性疾病和线粒体功能障碍的潜在生物标志物［12］。由于不同组织、RNA 质量和用药状态等因素，miRNA 尚未成为特异性诊断ASD 的生物标志物，后续研究需注重控制潜在影响因素，且扩大样本进行miRNA亚型之间的重复验证，从而确定最适用于ASD 诊断的miRNA 亚型。

1.2 lncRNA长链非编码RNA （long non-coding RNA，lncRNA） 是长度大于200 个核苷酸的非编码RNA，参与细胞分化、剂量补偿效应（Dosage compensation effect）、细胞周期以及表观遗传调控等神经活动。Parikshak 等［13］采用转录组测序技术（RNA-seq） 检测了48 例ASD 患者与49 名正常人的脑部尸检标本的lncRNA 表达水平，结果发现ASD 患者的lncRNA 存在灵长类动物特异性表达模式，于大脑中相对富集并富含ASD 风险基因，其中两种灵长类特异性的lncRNA（即 LINC00693 和 LINC00689）在ASD 患者皮质中被上调，而在正常发育期间是下调的。Wang 等［14］通过微阵列杂交（Microarray hybridization）和实时荧光定量 PCR（quantitative realtime PCR）比较 25 对 3～5 岁 ASD 和健康儿童的外周血 lncRNA 水平，发现 ASD 中的 13 种突触lncRNA 具有显著差异性表达，与HOX 基因有关的lncRNA 也存在差异性表达，并提出外周血lncRNA可能是诊断ASD 的潜在生物标志物。至今国内外对此研究存在样本量小、缺乏重复验证等局限性，进一步探究lncRNA 的分子作用机制与途径将有助于发掘lncRNA 与ASD 发病的相关性。

2 ASD 与细胞外信号调节蛋白激酶

细胞外信号调节蛋白激酶（extracelluar signalregulated protein kinase，ERK）是丝裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-aetivated protein kinases，MAPKs）的重要一员，参与MAPKs 的三级酶促级联反应，即MAPK 激酶的激酶 （Raf）-MAPK 激酶 （MEK）-MAPK（ERK，其中 ERK1 和 ERK2 是主要亚型）信号传导途径。通过连续的磷酸化步骤，ERK 信号传导通路将传入的细胞外信号从细胞表面受体转导至细胞核中，从而调控细胞存活、增殖、分化和迁徙以及细胞核内基因的转录与表达，同时参与一系列神经活动，包括突触可塑性的调节、大脑发育的调控、学习和记忆的形成等。

已有ASD 基因集和通路网络分析表明，MEK/ERK 信号传导通路与 ASD 联系密切［15］。Pucilowska等［16］发现小鼠模型 ERK1 基因或 ERK2 基因的缺失，均可导致孤独症样表现。有研究进一步表明，ASD 小鼠模型大脑皮质中MEK/ERK 信号通路的激活水平升高［17］。Faridar 等［18］发现刚出生和 30 日龄的BTBR 小鼠大脑的ERK 通路过度激活，尤其是刚出生的小鼠。Cheng 等［19］发现与对照组 B6 小鼠相比，刚出生的BTBR 鼠模型海马裂解液中磷酸化的 MEK （Phospho-MEK，p-MEK） 和磷酸化的ERK（Phospho-ERK，p-ERK）表达水平均升高。孙艳秋等［20］发现ASD 仔鼠模型在发育过程中额皮质ERK 的表达增加，于 14 日龄达到最大峰值，28 日龄趋于稳定。一项研究表明MEK/ERK 通路的活性受 MEK 抑制剂 U0126 特异抑制后，VPA 联合U0126 组大鼠海马、小脑组织及前额叶皮质中的p-MEK 和p-ERK 表达均显著下降，明显减轻了孤独症样行为［21］。Pucilowska 等［22］对产前及出生后 90 日龄的ASD 小鼠模型均使用ERK 特异性抑制剂细胞渗透肽RB1/RB3，模型小鼠的行为缺陷得到有效改善。基于ASD 鼠模型脑组织的MEK/ERK 通路过度激活，Faridar 等［18］还揭示了 ASD 鼠模型淋巴细胞中MEK 蛋白和ERK 蛋白的表达水平与其在鼠模型脑组织中的表达水平呈显著正相关性，提示ASD患者淋巴细胞中的MEK/ERK 通路可能失调，且推测或许可在ASD 患者外周血中开发相关生物标志物。对此，Erickson 等［23］首次通过免疫组化技术和蛋白质印迹法（Western Blotting）对ASD 患者外周血淋巴细胞ERK 表达展开研究，发现ASD 患者p-ERK 较对照组增加显著，并提出ERK 可考虑成为筛查ASD 的潜在生物标志物，但结果无法进行ASD 患者亚组的有效分析，包括临床症状程度、年龄、智力、服用精神药物等。下一步研究需扩大样本重复验证以确定外周血淋巴细胞中过度激活的ERK 是否等同于大脑中的ERK 失调，目前国内对此实证研究尚属空白，而且MEK 表达失调是否可在人外周血中检测尚不明确。

3 ASD 与淀粉样前体蛋白

淀粉样前体蛋白 （Amyloid precursor protein，APP）是一种单次跨膜蛋白，广泛存在于全身组织细胞中。APP 经a 分泌酶裂解后生成具有神经营养作用 的分泌 型 APP-α （secreted amyloid precursor protection alpha，sAPP-α）；但经 β 和 y 分泌酶裂解后的APP 产生在高浓度（nM）时表现为毒性作用的β-淀粉样蛋白 （β-amyloid，Aβ），Aβ 包含 40 或 42个氨基酸残基（Aβ1-40、Aβ1-42）。

近年有对照研究表明，ASD 儿童的外周血sAPP-α 水平较健康儿童增加明显，而且差异在不同程度病情ASD 间具有统计学意义［24］。这一研究结果经国内汪鸿等人扩大样本量后得到进一步证实，显示重度ASD 儿童的外周血sAPP-α 水平较轻-中度ASD 的增加显著，并发现父母亲高龄受孕、早产小孕周、出生体重轻、新生儿高胆红素血症及缺氧缺血性脑病是ASD 儿童sAPP-α 升高的影响 因 素［25］。Bailey 等［26］通过酶联免疫吸附 测定 法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA） 检测了25 例2～4 岁 ASD 儿童和25 名年龄匹配的健康儿童的血浆 sAPP-α 水平，发现 sAPP-α 在 60%的ASD 儿童中表达显著增加，故考虑sAPP-α 可作为早期识别儿童患 ASD 的辅助指标。Ray 等［27］用ELISA 法分析了 6 例轻-中度 ASD 儿童、15 例重度ASD 儿童以及18 名健康儿童的血浆样品，结果发现重度 ASD 儿童血浆 sAPP-α 表达显著增高；Aβ1-40、Aβ1-42 与 sAPP-β 显著下降； 轻-中度ASD 患儿与健康儿童对比无显著差异。研究提示外周血sAPP-α 可能是辅助诊断重度ASD 的潜在生物标志物。为进一步探讨APP 在ASD 外周血中表达的特异性，汪鸿等［28］对 103 例 ASD 儿童血浆总sAPP、sAPP-α 和 sAPP-β 采用 ELISA 法进行检测，且与 78 名健康儿童、25 例注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD） 儿童和 25 例智力障碍（intellectual disability，ID）儿童进行对比，结果显示：sAPP 和 sAPP-α 在 ASD、健康儿童、ADHD 和ID 之间差异有非常显著统计学意义，sAPP-β 的表达差异无统计学意义，证明外周血sAPP 和sAPP-α 表达在ASD 儿童中具有特异性，可作为疾病筛查的实验室指标。此外与36 名3～16岁健康儿童比较，52 例ASD 儿童的血浆Aβ1-40、Aβ1-42 和 Aβ40/Aβ42 比值均显著下降，且受试者工作特征曲线 （receiver operator characteristic curve，ROC）在区分ASD 及健康儿童上显示高度特异性与敏感性［29］。尽管以上研究尚未明确APP 是导致ASD 发病的直接原因，且sAPP-α 如何介导与ASD 相关的细胞信号传递仍是未解之谜，但APP 目前作为一种外周血生物标志物结合临床症状诊断ASD 是有参考意义的。

4 ASD 与免疫活性物质

4.1 细胞因子细胞因子（cytokine，CK）是一类由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，可介导和调节炎症反应、免疫应答，或作为生长因子促进靶细胞增殖、分化。Saghazadeh 等［30］对 38 项研究中涉及2487 名参与者 （1393 名 ASD 患者和 1094 名对照组） 的外周血细胞因子水平进行Meta 分析，发现ASD 患者外周血干扰素（Interferon，IFN）-γ、白介素（Interleukin，IL）-1β、IL-6 和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 的 浓 度 均 高 于 对 照 组 。Krakowiak 等［31］使用 Luminex Multiplex 技术对 214例 2～4 岁 ASD 儿童 （141 例重度 ASD，73 名轻-中度ASD）、62 名正常儿童和27 例发育迟缓（developmental delay，DD）儿童的出生48 h 内储存的血液样本进行细胞因子水平检测，结果发现新生儿期血清 IL-1β 和 IL-4 浓度增高者，患 ASD 风险增大；其中 IL-4 浓度升高者患重度ASD 风险增加1.4 倍，且与非语言的认知能力呈负相关；IL-1β 浓度升高者患轻-中度ASD 风险增加3 倍。研究提示IL-1β和IL-4 可为早期预测不同严重程度ASD 提供参考依据。有研究通过ELISA 法对42 例ASD 儿童和20名相匹配的正常儿童的血清细胞因子水平进一步分析，显示 ASD 儿童的 IL-1β，IL-4，IL-6 和 IL-13浓度较正常儿童显著升高，而且ROC 结果表明这4种因子可能是诊断 ASD 的潜在生物标志物［32］。Singh 等［33］对 30 例 ASD 儿童与匹配的正常儿童的血清成分进行检测，发现ASD 儿童血清IL-8 水平较对照组的高，而且促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）和IL-8 较其他表达差异的血清蛋白具有更高诊断水平。其中IL-8 诊断ASD 的灵敏度达94%、特异性为55%、准确率为74%；TSH 诊断的灵敏度达94%、特异性为60%、准确率为76%；结合两项指标诊断的灵敏度达89%、特异性为75%、准确率为 82%。Mostafa 等［34］用 ELISA 法检测62 例4～11 岁的ASD 儿童的血清上皮细胞衍生的中性粒激活胎78（ENA-78）水平，发现ASD 儿童的ENA-78 水平显著高于相匹配的健康对照组，且与ASD 儿童的血清抗神经自身抗体的升高显著相关，提出接下来应探讨ENA-78 拮抗剂对ASD 儿童的治疗作用。另有研究对84 例 ASD 儿童、49 例DD儿童和159 名正常儿童在出生48 h 内储存的血液样本进行检测，显示与正常儿童对比，ASD 儿童的单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1） 升高，DD 儿童的巨噬细胞炎症蛋白 1α（macrophage inflammatory protein-1alpha，MIP-1α）降低，表明检测新生儿血液中的免疫生化指标可能有助于早期识别异常的神经发育疾病［35］。目前细胞因子在ASD 诊断中的特异性尚未明确，甚至出现研究结果相矛盾，后续跨文化的纵向研究需更严谨以增加数据的可靠性和临床的应用性。

4.2 自身抗体自身抗体指针对自身组织，器官、细胞及细胞成分的抗体，其中抗脑抗体是一类能在血清中作用于脑组织的自身抗体。已有研究报道ASD 患儿的血清抗核抗体、骨桥蛋白、抗神经节苷脂抗体等抗脑抗体水较正常儿童显著升高，并与ASD 病情的严重程度呈正相关［36］。Al-Ayadlhi 等［37］采用ELISA 法对60 例 3～12 岁 ASD 儿童的血浆抗核小体特异性抗体进行检测，发现与健康儿童对比，ASD 儿童血浆内存在高水平的抗核小体特异性抗体，且存在自身免疫病家族史的ASD 儿童的血浆抗核小体抗体水平显著高于无自身免疫病家族史的ASD 儿童，提示可通过免疫生化指标来探究ASD 的发病机制及潜在的生物标志物。Frye 等［38］的研究发现，94 例ASD 儿童的叶酸受体α 自身抗体的封闭与ASD 特定的生理和行为特征有关，有助于进行ASD 的亚型分析。

4.3 其他ASD 患者体内存在一定具有特异性的分子或蛋白，可考虑作为早期诊断ASD 的标志物，如γ-氨基丁酸、干扰素γ 和催产素诱导的蛋白16（IFI16）与 SRS 和 CARS 量表得分均明显相关，三者可作为评估 ASD 严重程度的生物标志物［39］。Qasem等［40］发现ASD 患者体内8-差向前列腺素和半胱氨酰白三烯的浓度较正常人显著升高，提出二者可作为早期发现ASD 患者的生物标志物。此外，ASD 儿童的血浆新蝶呤水平增高，新蝶呤水平的检测可作为 ASD 的辅助诊断，正常不超过 8.5 nmol/L［41］。还有ASD 儿童的血浆脂氧素A4 水平降低，检测血浆脂氧素A4 也可作为诊断标准，正常儿童不低于81.5 pg/mL［42］。

5 展 望

迄今，ASD 病因与发病机制仍不明确，而且量表诊断主观性强，导致ASD 的早期识别、及时诊断以及有效干预相对滞后，故建立一种结合生物标志物和临床症候群为一体的ASD 诊断系统具有重大意义。其中血液采集相对简单快捷，侵入性和成本效益较低，是作为疾病诊断标志物的最佳来源之一，更适用于临床大规模筛查和诊断ASD。然而由于血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的存在，从外周血中找到ASD 蛋白标志物仍有一定难度，特别是源自大脑病变的相关疾病的特异性蛋白标志物。

目前，ASD 的生物学指标变化复杂多样，不同程度的病情由不同的神经系统病变决定，进而有不同的神经生化改变，无法确定以哪种生物标志物为主要标准。而APP 及其分解物在ASD 中相对特异，但大部分研究仍存在样本量小、方法学差异及缺乏跨文化的重复验证等局限性，使得临床应用受到限制。未来针对ASD 儿童的实验室检测，需要全面考虑患儿的年龄、起病经过、病情轻重程度以及有无并发症等因素进行分层研究，还要在样本量与标准化上获取更多支持，以增加检测结果的可靠性，进而开发不同阶段的特异性生物标志物。