基于网络药理学结合细胞和分子实验探究紫草素抗鼻咽癌的作用机制

郭兴喆，白先愚，杨萌哲，成南南，徐宁，周守常，覃柳洁，焦爱军

（1.广西医科大学 生命科学研究院，广西 南宁 530021；2.广西医科大学 生物化学与分子生物学教研室，广西 南宁 530021；3.广西医科大学 药学院，广西 南宁 530021）

0 引言

在我国，鼻咽癌是南方地区是最常见的恶性肿瘤之一[1]，全世界有超半数的鼻咽癌患者发生在中国，在西方学术界有“中国癌”之称[2]。在广西，鼻咽癌是排位在第四位的恶性肿瘤，近些年来，发病年龄趋于年轻化。医院就诊患者中大多数是中晚期，治疗效果不好，20年前的5年生存率只有60%左右[3]。对于局部进展期鼻咽癌患者，目前以顺铂为基础同步进行放化疗作为标准治疗。然而在化疗过程中，部分患者对化疗药物耐受性差需降低化疗剂量以降低药物毒性甚至暂停治疗。为了保证能够按时完成治疗，需探索新的同步化疗药物，减少治疗期间的毒副反应的同时保证疗效[4]。

紫草素是一种天然有机物，化学式为C16H16O5，英文名称为Shikonin，是从天然植物宗阜根中提炼的紫红色萘醌类化合物，具有灭菌、消炎、抗癌等作用。临床用于治疗肝硬化伴腹水以及急、慢性肝炎，局部还可应用修复伤口，促进创面瘢痕形成。有研究表明紫草素介导的PD-L1降解是通过下调NF-κB/CSN5和NF-κB/STAT3信号通路相关蛋白表达达到抗胰腺癌的作用[5]。这表明紫草素是良好的抗癌中药单体。本研究通过网络药理学的方法来分析预测紫草素对鼻咽癌的潜在靶点及相关信号通路，再通过实验验证其预测结果的有效性，从而为将来的临床研究提供了依据。

1 材料与方法

1.1 基于网络药理学的机制预测

1.1.1 化合物及鼻咽癌靶点的查询及筛选

通过Pubchem数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索关键词Shikonin得到其3D机构图，将3D结构图导入至Pharmmapper数据库（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.htmL）中筛得到紫草素相关靶点。通过GeneCards数 据 库（http://www.genecards.org/）搜索得到鼻咽癌相关靶点。通过venn在线平台（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）绘制药物和疾病靶点交集图。

1.1.2 紫草素与鼻咽癌靶点PPI（protein-protein interaction）的网络可视化构建及分析

通过String数据库（https://string-db.org/）将Venn图取交集得到的基因输入到String数据库构建PPI网络。把得到的PPI网络输入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化。通过软件中的Network Analysis plugin功能对可视化图中的节点进行统计，并根据Degree值的大小而区分节点的生物功能。

1.1.3 GO功能和KEGG pathway 通路富集

通过David数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对紫草素与鼻咽癌靶点交集进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，用以说明相关靶点在基因功能和信号通路中的作用。GO功能富集分析主要包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC）。通过在线作图平台微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）对富集分析结果进行可视化处理。

1.1.4 化合物-靶点-通路网络图构建

整合紫草素抗鼻咽癌的交集靶点和KEGG富集分析结果，并导入Cytoscape 3.7.2软件构建制作“化合物-疾病-靶点-通路”关系网络图。

1.2 实验验证

1.2.1 CCK-8法验证紫草素对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用

采用CCK-8法评价紫草素对CNE2 细胞增殖抑制作用，取在对数生长期的CNE2 细胞，用0.25%含EDTA的胰酶进行消化处理，重悬为单细胞悬液，以5000/孔接种于96孔培养板中，在37℃、5% CO2的培养箱中贴壁12 h，小心地吸出培养液，分别加入含紫草素的培养基100μL，浓度设为4umol/L，每组设3个复孔。在37℃、5% CO2的培养箱中培养 24、48、72 h 后，吸出含紫草素的培养基，用PBS清洗2遍，按照CCK-8使用说明书，每孔加入 100μL RPMI-1640 培养基和10μL CCK-8，于37℃、5% CO2的培养箱中孵育80 min。用酶标仪检测在450nm 波长下各孔的光密度（A），计算实验组紫草素对细胞的抑制率并绘制细胞抑制率曲线。实验重复3次。

细胞生存率＝(A 紫草素-A 空白)/(A 对照-A空白)

1.2.2 Western blot检测蛋白表达

取对数生长期的CNE-2细胞，倒置显微镜下观察计数，调整细胞密度为5×105/mL 接种于6孔板，每孔1.5mL，置于培养箱贴壁培养24h，药物分组处理细胞结束后，收集细胞，各实验组细胞用预冷的PBS缓冲液清洗3次，收集细胞后，加入预冷的细胞裂解液裂解细胞，混匀，超声破碎细胞；细胞液于4℃以12000r/min，离心15min，转移上清液于新的EP管中并用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。一定量的蛋白样品与上样缓冲液按比例混合后煮沸5min，SDSPAGE电泳150V恒压70min，WB 湿转(0.45μm的PVDF膜) 270mA恒流65h，5%脱脂奶粉室温封闭1h，TBST漂洗3次后分别加入相应一抗4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，室温二抗反应1h，TBST漂洗3次后进行ECL显色。用凝胶成像分析系统分析电泳条带，以内参作对照，计算各处理组目的蛋白的表达情况。

1.2.3 统计学处理

通过SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计量资料以表示，两样本均数比较使用t检验，组间均数比较使用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学机制预测

2.1.1 紫草素潜在靶点预测

通过PubChem 分子库获得紫草素3D结构。见图1。将3D结构导入至Pharmmapper数据库中筛得到紫草素靶点并通过Uniplot数据库取得基因名进行进一步校正，按照Norm Fit排序，选取前10个基因名称和靶点。见表1。

表1 紫草素排名前十的潜在靶点

图1 紫草素的3D结构

2.1.2 紫草素与鼻咽癌相关的共同靶点

从GeneCards 数据库获得与鼻咽癌相关的基因靶点共有 1929个。将1929个鼻咽癌相关基因与184个药物靶点基因取交集筛选出共同靶点109个，确定其为紫草素抗鼻咽癌的潜在靶点基因。见图2。

图2 紫草素抗鼻咽癌的潜在靶点

2.1.3 紫草素与鼻咽癌相关靶点的PPI网络

从分析蛋白来看，PPI 网络是了解疾病中多种复杂蛋白质相互交联功能的基础。因此，构建了紫草素与鼻咽癌相关靶点的PPI网络。将109个交集靶点导STRING数据库，获得紫草素-鼻咽癌靶点蛋白质互作信息，通过 cytoscage 3.6.1 软件，获得蛋白质相互作用(PPI)网络图。见图3。

图3 紫草素抗鼻咽癌PPI网络图

图4 紫草素抗鼻咽癌GO功能富集分析

该网络布局是根据节点的度值从小到大梯度按逆时针排序，黄色节点代表紫草素在鼻咽癌中的潜在靶点，内部节点之间的线显示不同蛋白质之间相互作用关系，度值最高的前70个节点。其中该网络中度值最高的靶点为MAPK1，度值为63，其次为SRC、AKT1、MAPK14、ESR1、HSP90AA1、MAPK8、CASP3、IGF1、JAK2等，这些度值较高的靶蛋白可能是紫草素抗鼻咽癌的关键靶点。

2.1.4 GO 功能富集注释

将疾病和药物交集的 51 个共同靶点通过DAVID数据库进行GO功能富集分析，根据P≤0.01，共筛选出478个GO条目。包括 40条细胞组成(cellular component,CC)、74条分子功能(molecular function,MF）和364条生物过(biological process,BP)。结果表明，涉及蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、激酶活性、AP结合蛋白、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、同蛋白结合蛋白、丝氨酸型内肽酶活性、蛋白质结合蛋白、内肽酶、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等分子功能；涉及多项生物调控机制，包括凋亡过程的负调控、蛋白质磷酸化、蛋白质自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、肽基丝氨酸磷酸化、缺氧反应、蛋白质水解、细胞迁移的正调控、MAPK级联、信号转导等生物过程；涉及细胞核、细胞质、核质等细胞组成。推测紫草素治疗鼻咽癌可能与蛋白激酶活性、激酶活性、细胞因子活性、AP结合蛋白等物质活性有关，涉及凋亡过程的负调控、蛋白质磷酸化等生物过程。

2.1.5 KEGG通路富集分析

通过DAVID数据库进行KEGG通路富集分析，共富集得到89条通路。根据P值排序，筛选出与鼻咽癌相关度最高的前16条通路。富集结果显示在癌症信号通路(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌症蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、Ras信号通路(Ras signaling pathway)、Rap1信号通路(Rap1 signaling pathway)等通路上富集较多。见图5。

图5 紫草素抗鼻咽癌KEGG富集结果

2.1.6 构建紫草素抗鼻咽癌的“药物-靶点-疾病-通路”网络模型

构建“药物-靶点-疾病-通路”网络模型，可直观的展示紫草素与鼻咽癌靶点及通路之间的相互作用以及关键途径。见图6。图中左侧40个黄色节点代表紫草素抗鼻咽癌交集的靶点，根据节点的degree值按逆时针从小到大梯度排列，右侧16个绿色节点则对应了KEGG富集结果中的16条通路，节点之间的连线显示不同靶点与通路之间相互作用关系，涉及的关键基因包括：MAPK1、AKT1、PIK3CG、MAPK8、EGFR、IGF1R、IGF1、MAPK14等。

图6 “药物－靶点－疾病－通路”网络图

2.2 实验验证

2.2.1 CCK8细胞毒性实验

结果如图7所示，与对照组比较，CNE2细胞增殖抑制率随着紫草素浓度的升高及作用时间的延长明显升高，作用24、48、72h的半抑制浓度（IC50）分别为5.48、4.76、2.36μmol/L。

图7 紫草素对鼻咽癌CNE2增殖的影响

2.2.2 Western blot实验检测紫草素对p-ERK和ERK蛋白表达的影响

Western blot实验结果显示，4μmol/L浓度的紫草素实验组ERK和p-ERK表达量显著低于空白对照组（P<0.01）。见图8。

图8 紫草素对CNE-2细胞MAPK/ERK信号通路通路蛋白的影响

3 讨论

中药单体在肿瘤治疗中所突出的显著疗效，使得近些年来在中药单体对相关肿瘤防止的研究上成为热门焦点[6]，是未来的研究方向和新的探索领域。新近的相关研究表示，紫草素对多种癌症肿瘤均有显著的抑制作用[7-9]，其在抑制鼻咽癌细胞增殖也有了一些研究成果，如邢亮等[10]使用紫草素作用于人胚鼻咽上皮HNE2细胞和鼻咽癌CNE2细胞后，实验结果显示紫草素可明显抑制HNE2细胞和鼻咽癌CNE2细胞株的增殖。

本研究基于网络药理学进行深入研究，先通过预测紫草素抗鼻咽癌作用靶点，分析其潜在的信号通路和生物过程，构建“药物-靶点-疾病-通路”模型，推测出紫草素抗鼻咽癌的作用机制，最后对预测结果进行相关实验验证。紫草素“药物-靶点-疾病-通路”网络显示MAPK1、AKT1、PIK3CG、MAPK8等度值相对较高，是紫草素治疗鼻咽癌的潜在靶点，结合KEGG通路富集分析显示MAPK/ERK信号通路是紫草素作用于鼻咽癌的关键通路。MAPK信号转导通路在多数人体细胞中都存在，通过把细胞外化学信号传递至细胞，引起细胞内部一系列生物学反应，如细胞增殖、转化、凋亡等过程，具有十分关键的作用。MAPK/ERK信号通路参与细胞分化、增殖、凋亡和血管生成等调节，在肝癌、结直肠和子宫内膜癌[11-14]等多种癌症发挥关键作用，是鼻咽癌发生发展的重要调节通路之一。在MAPK/ERK信号通路中，ERK蛋白是极其重要的通路蛋白之一，ERK蛋白是丝/苏氨酸激酶，可以通过磷酸化丝/苏氨酸发挥生物学作用。ERK蛋白在丝裂原刺激作用下接受上游分子的级联信号，然后通过转位进入胞核。此外，ERK蛋白除了可以磷酸化胞质蛋白外，还可以磷酸化部分核内的转录因子如c-myc、ATF2、c-fos、c-Jun、Elk-1分子等，从而调控细胞的增殖、凋亡、分化等生物学活动。因而ERK1和ERK2蛋白在MAPK/ERK信号通路处于信息传递的关键环节，其表达水平的下调，可直接影响细胞的增殖和凋亡。郑懿等人[15]的研究表示可通过下调 CCND1 基因的表达来抑制 ERK/MAPK 信号通路从而增进细胞的凋亡，对宫颈癌化疗敏感性的提高有明显作用；杨玮蔚[16]等的研究也表示RACK1可通过激活ERK1/2信号通路，抑制食管鳞癌Eca109细胞株的增殖，促进其凋亡，对食管癌的发生发展有更进一步的价值。因此本研究通过Western blot实验验证这条可能性最大的通路，显示出了紫草素对ERK1和ERK2蛋白表达具有制作用，证实通过网络药理学的预测，紫草素对鼻咽癌通过MAPK/ERK信号通路发挥作用。

本研究通过网络药理学靶点通路预测结合细胞实验、分子实验等对紫草素治疗鼻咽癌进行了系统性的比较分析，通过实验发现了紫草素对鼻咽癌的抑制作用并验证了其作用机制，为之后鼻咽癌的临床治疗及实验研究提供了依据和方向。