脂质体封装的介孔纳米药物治疗急性淋巴细胞白血病的研究

魏莉平，费安兴，李胜，张常亮，邹甜甜，王镀津★

（1.鄂东医疗集团市妇幼保健院 医学检验科，湖北 黄石 435000；2.鄂东医疗集团市中心医院（湖北理工学院附属医院）医学检验科，湖北 黄石 435000；3.肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 4 350003）

0 引言

白血病起病隐匿，在疾病早期缺乏特异性的检测手段，不易与其他血液性疾病相区分，这也导致了白血病确诊时多已经到中晚期，延误了最佳治疗时机。因此迫切需要研究开发新的诊治技术，使白血病患者能够早发现，早治疗[1-3]。

介孔二氧化硅纳米粒子（Mesoporous Silica Nanoparticle，MSN），是一种具有中空结构的新型纳米材料，其粒径大小，孔径大小以及孔容积都可以根据需要进行调节。介孔二氧化硅纳米粒子具有良好的组织相溶性，较低的人体毒性，是一种理想的化学药物运送载体。但是介孔材料都有孔的外在开口，装载的化学药物在运送过程中存在一定的泄露风险[4-6]。因此，科研人员研发了很多用于封堵介孔的方法。

脂质体（Liposome），是一类由磷脂分子组成的，具有类似细胞膜结构的纳米囊泡状结构。其易于合成，具有良好的组织相溶性，是一类良好的药物运送载体[7-9]。本研究利用脂质分子，在介孔二氧化硅纳米粒子表面形成一层脂质膜层，该膜层的应用具有以下优点：①能有效封堵介孔，防止药物运送过程中发生泄漏；②提供易于修饰的表面，便于修饰特异性靶向分子；③改进无机纳米材料表面的性状，使其在体液环境中更加稳定。

核酸适配体（Aptamer）是利用指数富集配体系统进化（systematic evolution of ligand and by exponential enrichment,SELEX）技术筛选的针对特异性靶点的小分子DNA或RNA。其具有类似于抗体的结合特性，化学性质稳定，筛选周期短，是理想的药物载体系统靶向分子。Sgc8是Xiao Zeyu 等人筛选出的具有T-ALL细胞株CEM特异性结合能力的核酸适配体，其靶分子为蛋白酪氨酸激酶7（PTK-7）。正常的T细胞不表达蛋白酪氨酸激酶7，利用这一优点，sgc8作为白血病治疗的靶分子，具有极大的应用前景[10-11]。

本研究构建了一种基于sgc8（Apt），脂质体（L）及介孔二氧化硅（M）的新型靶向纳米药物运载系统Apt-LM,其能够将DNA毒性药物靶向运送到白血病细胞内，精准杀伤白血病细胞，为白血病的精准诊疗提供了一种新的策略。

1 材料与方法

1.1 试剂

正硅酸酯（Tetraethylorthosilicate，TEOS），三羟基三乙胺（triethanolamine，TEA），3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-Aminopropyltriethoxysilane APTES），十六烷基三甲基氯化铵（Cetyltrimethylammonium chloride，CTAC，25wt%），购自Sigma公司。1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂（1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，POPC），二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（1.2-distearoyl-snglycerol-3-phosphoethanolamine-N-[amino（polyethylene glycol）-2000]（ammonium salt），DSPE-PEG2000），二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺（1.2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide（polyethylene glycol）-2000]（ammonium salt,DSPE-PEG2000-MAL），购自美国AVANTI公司。荧光染料（1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylind ocarbocyanineperchlorate，DiI）购自江苏碧云天公司。CCK-8试剂盒及阿奇霉素药物（DOX）购自美国Sigma公司。Sgc8核酸适配体（5’-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3’）及其修饰由上海生物工程有限公司合成。其他为实验室自配试剂。

1.2 细胞培养

CEM及 Ramos细胞使用含10%胎牛血清（Fet al Bovine Serum，FBS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM（dulbecco’s modified eagle medium）培养基培养，细胞均置于37 °C，5%CO2的培养箱中培养。

1.3 MSN纳米粒子合成

25g十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）和1g三羟乙基胺（TEA）溶于250mL去离子水中，95°C油浴冷凝回流，200rpm剧烈磁力搅拌1h，随后37.5mL正硅酸乙酯（TEOS，tetraethylorthosilicate）逐滴加入上述溶液，继续搅拌1h；产物自然冷却到室温，16000rpm，30min离心收集固体产物；产物分散在无水乙醇中，超声波清洗10min，16000rpm离心30min收集固体产物，重复上述过程3次。产物用无水乙醇分散，78℃硅油浴，在v/v10%盐酸乙醇中磁力搅拌并冷凝回流萃取6h，去除模板CTAC，重复上述步骤，直到CTAC萃取完全。离心收集固体产物，终产物使用20mL去离子水超声分散，加入50μl冰乙酸，25μLAPTES，室温下搅拌24h，用去离子水洗若干次，真空冷冻干燥24h，得到氨基修饰的MSN纳米粒子。为了获得FITC荧光基团修饰的MSN，适量羧基修饰的FITC及19.2mgEDC和28mgNHS融入2mLPBS溶液（pH7.4）。样品先在室温下磁力搅拌15min，之后氨基修饰的10mgMSN纳米粒子加入上述溶液，磁力搅拌反应24h。产物使用单蒸水16000rpm，15min清洗3次，终产物使用单蒸水分散保存备用。

1.4 M/DOX 合成

将盐酸阿霉素粉末溶解在PH 7.0的PBS溶液中，配置成0.5mg/mL的盐酸阿霉素溶液，-20℃避光保存备用。10mg MSN纳米粒子分散溶解在5mL盐酸阿霉素溶液中（0.5mg/mL），室温搅拌24h，16000rpm离心收集产物，用PH 7.0的PBS溶液清洗若干次，获得M/DOX纳米药物。使用紫外分光光度法测定药物包封率及载药量。计算公式为：

包封率（%）=纳米粒子中装载的阿霉素量/纳米粒子质量＊100%

包封率（%=）纳米粒子中装载的阿霉素量/总投药量＊100%

1.5 脂质体（L）制备

采用薄层水化法制备脂质体，将POPC，DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000按摩尔质量比50∶4∶1溶解在氯仿溶液中（制备荧光纳米粒子时加入适当比例DiI荧光基团），然后将其加入圆底烧瓶中，经旋转蒸发形成干燥薄膜，通入纯氮气排除剩余氯仿成分，然后真空干燥仪干燥过夜形成脂膜。用1 mL 浓度为300 mM的枸橼酸缓冲液（pH=4.0）进行水化，涡旋烧瓶使薄膜成分完全溶解在溶液中。然后在37℃水浴中超声15min，当溶液变得澄清透明后，再反复冻融3次（液氮和60℃）。再依次通过不同孔径（200nm、100nm和80nm）的膜，挤压15次形成直径在100nm左右的脂质体。

1.6 Apt-L制备

巯基修饰的Sgc8核酸适配体与DSPE-PEG2000-MAL按照1:10的摩尔比加入到1.5制备的脂质体中并混匀，在纯氮气保护条件下反应24h即得到Apt-L。

1.7 Apt-LM/DOX纳米药物制备

取100 微升1.6中制备的Apt-L，10mg MSN或M/DOX用移液枪上下混匀数十次，4℃环境中放置2周左右，16000rpm短时离心收集沉淀物，用pH 7.4的PBS溶液清洗若干次，即得到Apt-LM/DOX纳米药物。

1.8 纳米材料表征

分别将MSN,Apt-LM用单蒸水稀释，取各组材料放置于特制铜网上静止10分钟，用2%磷钨酸（pH 7.0）负染1min，用滤纸吸除多余的液体，H-7650电子显微镜电子束加速电压100 KV下拍摄纳米粒子图像。Zetasizer 电位仪（Zetasizer Nano S,Malvern，UK）和动态光散射（dynamic light scattering，DLS）的方法测定纳米材料粒径和电位。

1.9 流式细胞术检测Apt-LM荧光纳米探针白血病细胞靶向效果

收集对数期生长的CEM细胞及RAMOS细胞，按照2×105细胞/孔在六孔板中培养，分别设置control组，Apt组，Apt-LM组，每组重复3个孔。每个实验组加入相当于100nM浓度的各检测探针，培养2h。1200rpm，5min收集细胞，用PBS洗3次，用500μl PBS重悬，使用流式细胞仪（Epics XL 美国Beckman coulter）检测。

1.10 荧光显微镜检测Apt-LM荧光纳米探针白血病细胞靶向效果

收集对数期生长的CEM白血病细胞系，按照1×106细胞/孔在六孔板中培养，分别加入control组，LM组，Apt-LM组纳米探针，终浓度都为100μg/mL。培养24h，1200rpm，5min离心收集细胞，用PBS洗3次，用多聚甲醛（4%）固定30min。PBS洗3次，用1 mg/mL DAPI染核5min，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察纳米探针靶向效果。

1.11 体外纳米药物靶向效果检测

CEM细胞2x105/孔在六孔板中培养24h每孔加入相当于3μg/mLApt-LM/DOX的纳米药物，分别培养4h及24h，收集培养后的细胞，用PBS洗3次，用多聚甲醛（4%）固定30min，取各组材料放置于特制铜网上静止10min，用2%磷钨酸（pH7.0）负染1min，用滤纸吸除多余的液体，H-7650电子显微镜电子束加速电压100kV下拍摄细胞图像。

1.12 Apt-LM/DOX纳米药物释放实验及体外杀伤效果评估

1.12.1 Apt-LM/DOX纳米药物释放实验

取500μl（包含1mg阿霉素）Apt-LM/DOX，置于透析管（MWCO12000）底部，放入30mLpH值分别为5.0和7.4的PBS溶液中，37℃水浴避光震荡（150r/min，在不同的时间点，取出5mL透析液，同时加入5mL新鲜透析液，释放出的阿霉素量使用F7000分光光度计测量（Ex=485nm，Em=560nm）。

1.12.2 Apt-LM/DOX纳米药物体外杀伤实验

收集对数期生长的CEM细胞，按照2×105细胞/孔在5%CO2，37℃下培养24h，分别加入1、5、10、25及50μg/mL剂量Apt-LM纳米材料，培养24h，每孔加入10μlCCK-8溶液，继续培养3h，吸光度在酶标仪上450nm波长处测定。细胞毒性用实验组和未治疗组的活细胞百分比表示。收集对数期生长的CEM细胞，按照2×105细胞/孔在5%CO2，37℃下培养24h，分别加入阿霉素浓度为2、4、8、16μg/mL的LM/DOX、Apt-LM/DOX纳米药物，培养24h，每孔加入10μlCCK-8溶液，继续培养3h，吸光度在酶标仪上450nm波长处测定。细胞毒性用实验组和未治疗组的活细胞百分比表示。

1.13 快速冰冻切片检测Apt-LM/DOX纳米药物体内药物运送效果

收集对数期生长的CEM细胞，使用PBS调整浓度到1×106/mL。将雌性5周雌性NOD/SCID小鼠随机分成2组，每组3只。分别在每只小鼠前肢腋下注射200μl CEM细胞悬液。使用游标卡尺监测肿瘤大小，待肿瘤生长到直径约5mm×5mm时,两组小鼠分别自尾静脉注射200μl Apt-LM及Apt-LM/DOX纳米药物 。24h后，钝性分离出小鼠肿瘤组织，快速冰冻切片，裱片后，使用冰丙酮固定5min，PBS漂洗后，用DAPI染色3-5min,纯水洗净，通过荧光显微镜观察Apt-LM/DOX体内药物运送效果。

1.14 统计学方法

使用 SPSS 19.0 以及GraphPad Prism 6软件进行统计学分析。计数资料用n（%）表示，计量资料以（）表示。两组均数比较采用两独立样本t检验；以P<0.05 为差异有统计学意义。流式细胞术检测结果使用Beckman Kaluza C软件分析。

2 结果

2.1 图1展示了Apt-LM/DOX纳米药物靶向治疗白血病示意图。

图1 Apt-LM/DOX纳米药物靶向治疗白血病示意图

2.2 Apt-LM表征检测结果

图2A展示的是MSN纳米材料的比表面积及介孔大小情况，合成的介孔二氧化硅纳米材料比表面积均值为587.43m2/g，介孔大小均值在2.75nm。电子显微镜照片（图2B）显示Apt-LM粒径均分布均匀。粒径及电位检测结果（图2C）显示Apt-LM纳米药物载体粒径分布在66.3 nm，电位分布在-16.7mv左右，以上结果显示我们获得了分散均匀，大小一致的Apt-LM纳米粒子。

图2 Apt-LM表征检测

2.3 流式细胞术检测Apt-LM荧光纳米探针白血病细胞靶向效果

从图2可知Apt-LM纳米粒子与CEM细胞的结合率最高达到83.1%，而其与对照组ROMAS细胞结合率只有12.1%。且Apt-LM与CEM细胞的结合效率与单独的Apt组相比较差异有统计学意义（＊＊P<0.05）。

2.4 Apt-LM纳米载体体外靶向作用验证

本研究在MSN纳米材料表面修饰FITC荧光基团，在脂质体分子上修饰DiI荧光基团，用于观察其对CEM细胞的靶向作用。如图4，我们在Apt-LM组中细胞内观察到了最强的荧光，而在未修饰靶向分子的LM组中没有观察到荧光，证实了Apt-LM纳米粒子对CEM细胞的靶向作用。

图3 流式细胞术检测Apt-LM与CEM及RamosS细胞结合效率（图3A）及统计图（图3B）,**P<0.05。

图4 荧光显微镜观察Apt-LM靶向效果，蓝色：细胞核（DAPI）；绿色：FITC标记的MSN，红色：脂质体（DiI）。

2.5 Apt-LM/DOX纳米药物释放及体外杀伤效果检测

本研究在pH为5.0和7.4的PBS溶液中模拟了药物的释放过程，在pH为5.0时，48 h内释放了超过60%的化疗药物DOX，而在pH为7.4的液体中，药物的释放量不超过25%。Apt-LM纳米材料毒性评估实验中，当纳米材料浓度达到50μg/mL时，细胞活性仍能保持在90%以上。体外杀伤实验证实Apt-LM/DOX能靶向杀伤CEM细胞，其与没有结合靶向分子的LM/DOX组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.6 透射电镜观察细胞纳米药物摄入效果

图6A为Apt-LM/DOX纳米药物与CEM细胞作用4h后拍摄的细胞透射电镜图，可以观察到4h已经有Apt-LM/DOX纳米药物进入到细胞的胞质内部。图6B为Apt-LM/DOX纳米药物与CEM细胞作用24h后拍摄的透射电镜图，观察到一个凋亡的肿瘤细胞内有大量的Apt-LM/DOX纳米药物。

图5 Apt-LM/DOX纳米药物释放实验及体外杀伤效果评估

图6 Apt-LM/DOX纳米药物与CEM细胞作用4 h后拍摄的细胞透射电镜图（图6A），Apt-LM/DOX纳米药物与CEM细胞作用24 h后拍摄的透射电镜图（图6B）

2.7 快速冰冻切片检测Apt-LM/DOX纳米药物体内药物运送效果

由于阿霉素（DOX）自带红色荧光的性质，我们通过给荷瘤小鼠静脉注射Apt-LM/DOX纳米药物，通过肿瘤组织切片我们观察到Apt-LM/DOX治疗组肿瘤内部有大量红色的荧光，说明Apt-LM/DOX纳米药物可以在体内靶向到肿瘤部位。

3 讨论

白血病起病隐匿，危害性大，临床上用于其治疗的药物如长春新碱，顺铂，阿霉素都会存在着一定的副作用。如何实现在体内特异性杀伤白血病细胞，是白血病治疗药物开发与应用的难点。核酸适配体的出现，为药物的靶向运输提供了很好的工具，新型纳米材料的出现，为药物的装载与运输提供了新的平台。

二氧化硅具有良好的组织相容性，粒径大小可以根据反应条件进行调整，通过对其表面进行改性和修饰，可以作为药物运输，生物成像，生物传感等应用的优良载体[12-15]。但是MSN用于靶向药物的运输也会存在药物在运送过程中泄露的风险，因此我们合成了脂质体纳米囊泡用于改进MSN表面特性以及封堵介孔的外口，可以有效阻止药物分子的泄露。Sgc8是Xiao Zeyu 等人筛选出具有T-ALL细胞株CEM特异性结合能力的核酸适配体，其靶分子为蛋白酪氨酸激酶7（PTK-7）[16]。徐康力等人的最新研究证实，sgc8在人的AML、T-ALL和正常骨髓样本中具有特异性识别能力，且对不同AML亚型可能具有不同的诊断价值[17]。正常的T细胞不表达蛋白酪氨酸激酶7，利用这一优点，我们将sgc8作为白血病治疗的靶向分子。

通过图1表征分析，我们合成的Apt-LM纳米药物运送载体粒径大小均匀，分散良好。流式细胞术检测的到Apt-LM纳米粒子相较于单独的Sgc8适配体具有更高的CEM结合效率，这主要得益于LM提供了很多的结合位点，从而使Apt-LM纳米粒子上可以同时结合多条Sgc8适配体，增大了与靶细胞的结合的能力。体外荧光靶向实验也证实Apt-LM对CEM细胞具有更高的靶向效率，图4中红色与绿色荧光的重合，也间接证实了我们合成的LM载体是成功的。Apt-LM/DOX模拟体内药物释放实验证实，Apt-LM/DOX在pH 7.4的环境中释放缓慢，而在pH 5.0的环境中能快速释放DOX，人体的血液环境pH值为 7.4左右，间接证明其在体液环境中不会发生大量的化学药物泄露的风险。我们证实了Apt-LM载体对细胞的生长没有抑制作用，CCK-8实验证实Apt-LM/DOX纳米药物对CEM细胞具有特异性杀伤效果。值得注意的是，在我们的体外杀伤研究中，DOX实验组的杀伤能力最强，这是由于DOX药物直接与CEM细胞接触，但是DOX缺乏特异性，对正常人体细胞也会存在杀伤作用，所以在安全性方面Apt-LM/DOX纳米药物更好。我们分别选取了与Apt-LM/DOX纳米药物作用了4小时及24h的CEM细胞，观察到Apt-LM/DOX能靶向进入到CEM胞质，并且发现与Apt-LM/DOX纳米药物作用了24h的CEM细胞产生了大量凋亡。

图7 肿瘤组织荧光成像。

最后我们通过荷瘤小鼠尾静脉注射Apt-LM/DOX纳米药物，通过观察肿瘤组织内药物分布情况来进一步验证Apt-LM/DOX纳米药物体内靶向效果，结果在肿瘤组织内发现了DOX药物的富集，证实了我们合成的靶向药能在体内靶向到肿瘤部位。在接下来的研究中，我们会进一步评估Apt-LM/DOX纳米药物体内的治疗效果。

4 结论

Apt-LM/DOX纳米药物能够有效靶向白血病细胞CEM，具有很好的开发应用前景。