基于生物信息学方法筛选EV71 感染的关键基因和通路＊

单志鸣，杨俊梅，孙红启，李铁威，成怡冰

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）作为一种常见儿童感染性疾病，多累及2～5 岁儿童，主要表现为口腔黏膜溃疡性疱疹及四肢末端水疱样皮疹，主要病原为肠道病毒，常见为柯萨奇病毒 A 组 16 型（Coxsackie virus A16，CA16）和肠道病毒 71 型 （Enterovirus 71，EV71），EV71 不仅引起手足口病，而且可引起严重中枢神经系统并发症，如脑膜炎、脑炎、急性迟缓性瘫痪等［1］。随着生物信息学的快速发展，通过分析筛选可以找到致病后差异表达的基因或蛋白，进一步探索其在疾病发生过程中的分子机制。笔者通过分析美国国立信息技术中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）下属的基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）［2］中 EV71 感染组和对照组的基因表达差异，探讨EV71 在感染宿主细胞后差异表达的基因，并分析这些差异表达基因所参与的生物学过程，以及在EV71 感染过程中发挥关键作用的通路途径，更好地揭示EV71 感染人体的分子机制，为后续研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 数据来源在GEO 数据库中以“EV71”检索，对检索结果按照如下标准筛选：（1） 至少3 个生物学重复；（2）研究设计有对照组。筛选后得到数据集GSE136668，其包含EV71 感染人扁桃体上皮细胞组和对照组共6 个样本，使用HiSeq X Ten （Homo sapiens）平台对提取的RNA 进行高通量测序，下载基因矩阵文件后续分析。

1.2 筛选差异表达基因用在线分析网站NetworkAnalyst （https：//www.networkanalyst.ca/Network Analyst/）［3］基因表达矩阵分析模块 edgeR1 对下载的基因矩阵文件进行差异基因分析，设置筛选标准为：感染组与对照组相比差异倍数2 倍以上，P＜0.05（log|FC|＞1，P＜0.05）。

1.3 差异基因GO 分析和KEGG 分析对符合筛选标准的差异基因在NetworkAnalyst 网站的基因列表分析模块做功能富集分析，基因本体（gene ontology，GO）分析主要是对基因的生物学功能进行注释分析，主要包括分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular components，CC）和生物学过程（biological process，BP）。京都基因与基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 分析是将基因组信息与基因高级功能信息联系起来，系统分析基因参与的生物学功能，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

1.4 蛋白互作网络构建（protein-protein interaction，PPI）通过构建PPI 网络能够分析差异表达基因的蛋白互作关系和关键基因模块。用差异表达基因导入 STRING 在线分析网站（http：//www.stringdb.org/）［4］，对基因所编码蛋白之间的相互作用展示，筛选条件为：互作得分＞0.4；将互作文件导入Cytoscape 软件［5］，用 MCODE 插件筛选关键基因模块，设置参数 degree cut-off 值为 2，node score cutoff 值为 0.2，K score 值为 3，Max.Depth 值 为 100，Cytohubba 插件筛选MCC 等级前十的hub 基因。

2 结 果

2.1 感染组与对照组差异基因用NetworkAnalyst分析得到9443 个差异表达基因，4703 个基因表达下调，4740 个基因表达上调，以 log|FC|＞1，P＜0.05为条件筛选后得到251 个，其中173 个基因上调，78 个基因下调，上调和下调logFC 排序前10 见表1。

2.2 差异基因GO 分析和KEGG 分析结果GO分析结果显示分子功能模块主要富集在蛋白结合、DNA 结合、核染色质结合、细胞之间钙调结合、连接酶活性、微管蛋白结合和调节复合物结合，细胞组分主要富集在细胞核、细胞质、胞质、核质、核仁、中心体、蛋白复合体、细胞之间粘着结合、细胞骨架和微管，生物学进程主要富集在DNA 模板转录、DNA转录调节、细胞分裂、负相调节DNA 转录、凋亡进程、有丝分裂细胞核分离、姐妹染色体结合、细胞对DNA 损伤应激反应和丝裂原激活蛋白激酶激活（表2）；KEGG 分析结果主要富集在沙门氏菌感染、RNA转运、mRNA 监视通路、MAPK 信号通路、p53 信号通路、癌症中转录失调通路、EB 病毒感染、百日咳等通路途径（表3）。

2.3 蛋白互作网络构建结果通过STRING 在线分析，差异基因互作网络有187 点，433 个连线（图1），使用Cytoscape 软件MCODE 插件分析得到核心互作模块（图2）以及cytohubba 插件筛选出MCC 等级前 10 的 hub 基因（图3），分别为 CENPF、KNTC1、BRCA1、HELLS、KIF20B、CASC5、ECT2、KIF14、ASPM、CENPJ。

图1～3 见封三。

2.4 关键基因BRCA1 调控靶基因分析对hub基因的功能和参与生物学途径分析发现，这些关键基因参与病毒感染相关的免疫调控和细胞凋亡过程，此外BRCA1 编码的转录因子既可以负向调节促炎反应调控通路靶基因，也可正向调节表皮生长因子受体（EGFR）、胰岛素样生长因子（IGF-1）等促进机体修复的靶基因表达，结果如图4 所示。

表1 差异基因列表

表2 差异基因GO 分析结果

表3 差异基因KEGG 分析结果

图4 BRCA1 调节靶基因结果

3 讨 论

手足口病作为一种常见的儿童感染性疾病，EV71 是引起手足口病最常见的致病病毒之一，常引起重症手足口患儿发生无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等严重并发症［6］，严重威胁着儿童的身体健康，深入研究EV71 引起神经系统症状的分子机制对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。随着高通量测序技术的发展，研究疾病中差异表达基因更加便捷。

利用公共数据库中的测序数据，综合分析EV71 感染组和正常对照组的差异表达基因，提示其可能参与EV71 感染人体的生理过程并发挥着重要的生物学功能。通过在线分析网站Network Analyst 对下载的基因矩阵文件进行基因名转换和标准化，分析感染组和对照组差异表达基因，按照2倍以上的变化和P＜0.05 为筛选条件，得到差异表达基因251 个，其中173 个基因表达上调，78 个基因表达下调，进一步对251 个差异基因做基因的富集分析，预测了这些差异基因参与的生物功能和通路，GO 分析结果显示这些差异基因可能通过影响蛋白质DNA 结合、细胞之间钙调结合和粘着以及微管蛋白结合参与感染的进程，还可能通过调节DNA 转录、细胞分裂与凋亡进程和细胞对DNA 损伤应激反应影响感染的过程。KEGG 通路富集结果显示这些差异基因参与的调节通路有沙门氏菌感染和EB 病毒感染以及 MAPK 信号通路和p53 信号通路等，MAPK 信号通路广泛参与调节细胞的多种生理过程，包括炎症、应激、细胞生长分化和凋亡。研究表明［7］EV71 感染人体后通过激活体内的固有免疫系统促进一系列炎性细胞因子的分泌，干扰病毒的复制和参与调节病毒的免疫逃逸机制并会激活 MAPK 信号通路。xie 等报道［8］EV71 感染后会激活p38、ERK1/2 和JNK1/2 信号通路，进而促进白介素6 和白介素8 等细胞因子的释放，zhang 等的研究也表明体外实验中p38 抑制剂可以减弱EV71诱导的细胞凋亡。还有两项研究［9，10］结果发现 EV71的非结构蛋白3C 可以影响MAPK 下游信号分子结构，从而抑制细胞因子的产生，因此，MAPK 信号通路参与调节细胞因子的释放和感染细胞的凋亡，在EV71 感染的过程中具有重要作用。进一步对251个差异基因构建了蛋白互作网络，筛选感染相关的关键基因，Cytohubba 等级前十的基因分别为CENPF、KNTC1、BRCA1、HELLS、KIF20B、CASC5、ECT2、KIF14、ASPM、CENPJ，并且它们也存在于核心互作模块，更进一步表明这10 个基因可能作为关键基因参与EV71 感染的过程，对其功能注释分析发现基因BRCA1 编码蛋白为转录因子。转录因子作为重要的生命过程调节蛋白，可以通过与基因的启动子区域结合调控基因的表达水平。通过JASPAR 网站［11］分析发现，BRCA1 编码的转录因子负向调节的靶基因中 EGFR 依赖的信号通路是重要的促炎反应调控通路，在病原体感染时EGFR 基因表达如果受到抑制，会导致抵抗病原体的能力下降。一项研究［12］就证明miR-27a 可以通过靶向下调EGFR 基因表达，从而抑制EV71 病毒的复制；另一个靶基因IRF3 可以促进EV71 感染后促炎因子和干扰素的生成［13］，抑制这些基因的表达都有利于机体对病原的抵抗。此外，BRCA1 还可以正向调节靶基因SATA1/2 以及E2F6 等。在干扰素刺激后，作为调控因子SATA1/2 通过增加促进炎症因子生成来抵抗病毒复制［14］，同样E2F6 可以调节细胞的增殖分化和调节细胞凋亡［15］。以上结果提示 BRCA1 作为关键调节因子可能参与EV71 感染的重要过程。