影响非远处转移性胃癌预后相关miRNA网络图构建

胡仁旺， 龚建平

华中科技大学同济医学院附属同济医院胃肠外科，湖北 武汉 430000

胃癌是常见的消化系统肿瘤，晚期预后较差[1-2]。对于非远处转移性胃癌，目前的主要治疗方法仍为手术治疗。近年来的研究发现，影响患者术后总体生存率的因素不仅与患者的病理分期有关，还与预后相关的基因表达有关，如各种mRNA、miRNA、lncRNA等[3-5]。miRNA是一种内源性非编码小RNA，通过与其靶基因mRNA结合从而发挥生物学功能。miRNA虽然不直接参与蛋白的合成，但其对于靶基因mRNA具有很重要的调控作用，如调控肿瘤细胞的增殖、侵袭等功能[6-7]。TCGA数据库是目前最大的肿瘤数据库，目前得到很多高质量文献的引用[8-9]，包含大量的患者临床信息和基因测序信息，其中就包括本文所关注的miRNA的表达信息。临床工作中对患者的miRNA进行全基因组测序，不仅价格昂贵，而且样本量不大，常局限在几例或几十例范围之内，因此得出的结果有时会存在误差。TCGA数据库是一个实时更新患者临床信息的公开数据库，因此对其进行miRNA的相关分析，结果较为可靠，且可作为后期临床针对性筛选miRNA的参考，因此具有一定的临床意义。

1 材料与方法

1.1 数据来源通过TCGA数据库下载非远处转移性胃癌患者的临床信息和miRNA表达信息，通过R软件将二者合并，并删除临床信息缺失的患者信息。通过三个miRNA数据库(miRDB数据库、miRTarBase数据库、TargetScan数据库)下载其miRNA对应的靶向基因mRNA的信息，并对三个数据库取交集合并。

1.2 分析思路首先筛选出正常组织和肿瘤组织之间差异表达且具有统计学意义的mRNA和miRNA，然后通过生存分析筛选出影响患者术后总体生存率的miRNA，并对这些miRNA进行多因素Cox回归分析，筛选出独立影响患者预后的miRNA。利用miRNA数据库(miRDB数据库、miRTarBase数据库、TargetScan数据库)寻找独立预后miRNA的靶基因mRNA，并对靶基因mRNA进行生存分析、GO(Gene Ontology)通路富集分析、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析和蛋白互助网络(PPI)构建。详细流程图如图1所示。

图1 文章分析流程 Fig 1 The process of article analysis

1.3 统计学方法生存分析采用Kaplan-Meier法，单因素Cox回归分析、多因素Cox回归分析、基因通路富集分析均通过R软件完成，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳入患者基本临床信息通过删除缺失值，最终纳入非远处转移胃癌患者349例，男227例，女122例，中位年龄67岁，四分位间距IQR 58～73岁，病理分级：Ⅰ级7例，Ⅱ级118例，Ⅲ级224例。病理分期：Ⅰ期46例，Ⅱ期124例，Ⅲ期166例，Ⅳ期13例。T分期：T1期18例，T2期76例，T3期169例，T4期86例。N分期：N0期113例，N1期95例，N2期74例，N3期67例。

2.2 生存相关miRNA筛选通过Kaplan-Meier法对差异表达的miRNA进行生存分析，筛选出13个miRNA(hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-4521、hsa-miR-187-3p、hsa-miR-518a-3p、hsa-miR-652-5p、hsa-miR-379-3p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-520f-3p、hsa-miR-518b、hsa-miR-516b-5p)明显影响胃癌患者术后总体生存率(见图2)。

2.3 多因素Cox回归分析筛选独立预后miRNA对影响患者术后总体生存率的13个miRNA进行多因素Cox回归分析，筛选出3个独立预后的miRNA：hsa-miR-652-5p(HR=0.817，95%CI：0.674～0.990，P=0.039)、hsa-miR-379-3p(HR=1.231，95%CI：1.015～1.493，P=0.034)、hsa-miR-4521(HR=0.664，95%CI：0.504～0.874，P=0.004)。可见hsa-miR-379-3p是影响胃癌预后的危险因素，随着hsa-miR-379-3p基因表达量的增加，胃癌术后总体生存率降低。而hsa-miR-652-5p、hsa-miR-4521基因表达量的增加并不降低胃癌术后的总体生存率(见图3)。

图2 13个影响非远处转移性胃癌患者术后总体生存率的miRNA生存曲线

图3 多因素Cox回归分析 Fig 3 Multivariate Cox regression analysis

2.4 独立预后miRNA风险生存曲线将独立预后的3个miRNA(hsa-miR-652-5p、hsa-miR-379-3p、hsa-miR-4521)作为一个整体进行Cox回归分析，发现高风险患者的术后总体生存率明显低于低风险患者，差异有统计学意义(P=4.42e-03)(见图4)。

图4 独立预后相关miRNA风险生存曲线 Fig 4 The risk survival curve of independent prognosis related miRNA

2.5 临床独立预后分析将独立预后的3个miRNA(hsa-miR-652-5p、hsa-miR-379-3p、hsa-miR-4521)作为一个整体与患者的临床指标(年龄、性别、病理分级、病理分期、T分期、N分期)合并，然后进行单因素Cox回归分析和多因素Cox回归分析。通过单因素Cox分析我们发现：年龄(HR=1.022，95%CI：1.003～1.041，P=0.021)、病理分期(HR=1.542，95%CI：1.204～1.975，P<0.001)、T分期(HR=1.331，95%CI：1.057～1.677，P=0.015)、N分期(HR=1.227，95%CI：1.040～1.446，P=0.015)、miRNA风险评分riskScore(HR=2.463，95%CI：1.572～3.859，P<0.001)均为影响胃癌患者预后的风险因素。通过多因素Cox回归分析发现，年龄(HR=1.029，95%CI：1.009～1.050，P=0.004)、miRNA风险评分riskScore(HR=2.533，95%CI：1.617～3.969，P<0.001)仍是胃癌患者术后总体生存率的独立危险因素(见图5)。因此，独立预后的3个miRNA(hsa-miR-652-5p、hsa-miR-379-3p、hsa-miR-4521)的表达量可作为预测胃癌术后总体生存率的独立指标。

2.6 miRNA靶基因预测及miRNA-mRNA网络图构建通过三个最常用的miRNA数据库(miRDB数据库、miRTarBase数据库、TargetScan数据库)，下载其miRNA对应的靶向基因mRNA的信息，并对三个数据库取交集合并。为了提高准确率，认为只有当一个miRNA对应的靶基因mRNA同时符合这3个数据库时，才将其纳入为靶基因，并将基因名称输出。然后将筛选到的靶基因与上文筛选出来的胃癌正常组织和肿瘤组织差异表达的mRNA进行合并取交集，找出差异表达的靶基因mRNA。通过合并分析，3个miRNA(hsa-miR-652-5p、hsa-miR-379-3p、hsa-miR-4521)的靶基因最终筛选出28个：PERP、SMIM6、ITPKB、MAP1B、IGF2、THBS2、PRR7、DLGAP5、ELL2、CENPF、MXRA5、UBE2C、CKAP2、HOXC10、FAM84B、MET、FOXM1、C4orf3、ECT2、CCDC34、CPE、CXCL10、CXCL3、TIMP3、F2RL2、GLUL、EMP1、CKB。这28个基因均是在胃癌正常组织和肿瘤组织差异表达的mRNA。通过Cytoscape软件[10-11]对独立预后的miRNA和差异表达的靶基因mRNA构建miRNA-mRNA网络图详情(见图6)。

图5 单因素和多因素Cox回归分析 Fig 5 Univariate and multivariate Cox regression analysis

注：三角形符号代表miRNA,椭圆形符号代表mRNA,红色代表基因上调，绿色代表基因下调。

2.7 靶基因(mRNA)通路富集分析对纳入的28个靶基因mRNA进行基因通路富集分析。目前常用的基因通路富集分析包括GO通路富集分析[12]和KEGG通路富集分析[13-14]。其中GO通路富集分析又包括BP(biological process)、CC(cellular components)和MF(molecular function)三种方法，BP方法主要研究生物学过程的基因通路，CC方法主要研究细胞学功能的基因通路，MF方法主要研究分子生物学功能的基因通路。如图7所示，横坐标代表基因通路上富集到的基因个数，纵坐标代表富集到的基因通路。P<0.05为差异有统计学意义的基因通路。GO通路富集分析：BP法富集到278条基因通路(图中仅显示前30条)、CC法富集到22条基因通路、MF法富集到36条基因通路(图中仅显示前30条)。KEGG通路富集分析富集到12条基因通路。详细基因通路名称如图中纵坐标所示，如肿瘤中的蛋白多糖基因通路(proteoglycans in cancer)、细胞核分裂的正调控基因通路(positive regulation of mitotic nuclear division)等。

2.8 靶基因(mRNA)预后相关基因生存曲线对纳入的28个靶基因mRNA进行Kaplan-Meier法生存分析发现，ECT2基因和IGF2基因均为影响胃癌术后总体生存率的mRNA，差异有统计学意义(P均<0.05)(见图8)。

2.9 靶基因(mRNA)PPI网络图构建通过String数据库[15-16]对纳入的28个靶向mRNA进行PPI构建，删除网络中无关联性的基因，我们发现，ECT2基因编码的蛋白与CKAP2、DLGAP5、UBE2C、FOXM1、CENPF等基因编码的蛋白具有明显的互助关系。IGF2基因编码的蛋白与MET、ITPKB等基因编码的蛋白具有明显的互助关系(见图9)。

图7 靶基因通路富集分析 Fig 7 Enrichment analysis of target genes

图8 预后相关的靶基因生存曲线 Fig 8 Survival curves of target genes related to prognosis

图9 靶基因的PPI网络图 Fig 9 PPI network diagram of target genes

3 讨论

近年来胃癌的发病率有升高趋势，严重威胁着人们的生命健康，随着研究的深入和各种治疗方案的出现[17-18]，目前胃癌患者的总体生存率得到了一定的提高。miRNA近年来受到越来越多学者的关注，各种新miRNA的发现，各种miRNA功能的探索及各种miRNA文献的发表均提示miRNA与肿瘤的发生、发展之间有着密切的联系[19-20]。miRNA虽然不直接编码蛋白参与人体的生物学功能，但其通过与靶基因mRNA结合，调节mRNA的表达，从而影响肿瘤的进展。本文通过R软件使用“edgeR”包，首先筛选出在正常组织和肿瘤组织中差异表达的miRNA，且差异倍数在2倍以上。然后通过Kaplan-Meier法对差异表达的miRNA进行生存差异筛选，筛选到13个在非远处转移性胃癌中影响术后总体生存率的miRNA。为了得到更有临床意义的miRNA列表，继续对这13个miRNA进行多因素Cox回归分析，最终纳入3个独立预后的miRNA(hsa-miR-652-5p、hsa-miR-379-3p、hsa-miR-4521)。将这3个miRNA与患者的临床指标，如年龄、性别、病理分级、病理分期、T分期、N分期等指标合并，并进行单因素和多因素Cox回归分析，再次证明了这3个miRNA为非远处转移性胃癌的独立危险因素，差异均有统计学意义。因此，研究这3个miRNA的生物学功能具有很重要的临床意义。

目前关于hsa-miR-652-5p、hsa-miR-379-3p、hsa-miR-4521这3个基因在胃癌中的文献研究较少，有文献证实，DNA甲基化介导的hsa-miR-652-5p表达通过靶向抑制PARG和VEGF通路途径促进食管鳞状细胞癌的侵袭[21]，也有文献报道hsa-miR-652-5p基因在乳腺癌的预后中发挥着重要作用[22]。而对于hsa-miR-379-3p基因，有研究证实其与胃癌的预后相关[23]，但具体机制尚不清楚。对于hsa-miR-4521基因，有研究表明，miR-4521-FAM129A通过TIMP-1/MMP2/MMP9和MDM2/p53/Bcl2/Bax通路途径对肾透明细胞癌的进展轴向调控，明显影响其预后[24]。通过文献检索我们发现，这3个miRNA目前在胃癌中的相关研究较少，但在其他肿瘤或疾病的研究中有部分文献，可以为我们提供参考，同时也说明本文发现的这3个miRNA具有一定的新颖性和可研究性。

miRNA是通过与靶基因mRNA相结合后发挥生物学功能的，因此，探讨这3个miRNA的靶基因显得很有必要。miRDB数据库[25-27]、miRTarBase数据库[28-29]和TargetScan数据库[30]是目前最常用的三个miRNA数据库，得到了大量权威文献的引用。通过这三个数据库均可查询到miRNA的靶基因，为了提高靶基因mRNA的准确性，将这三个miRNA数据库合并取交集，认为只有当一个miRNA对应的靶基因mRNA同时符合这3个数据库时，才将其纳入为靶基因，并将基因名称输出。然后为了得到具有临床意义的靶基因mRNA，再将靶基因mRNA与非远处转移性胃癌患者中正常组织和肿瘤组织差异表达的mRNA取交集，筛选出差异表达的靶基因mRNA。通过层层筛选，最终筛选出28个靶基因mRNA，然后继续用Kaplan-Meier法对这28个靶基因进行生存差异筛选，P<0.05为差异有统计学意义。最终筛选出2个对生存有影响的靶基因mRNA(ECT2、IGF2)。通过生存分析我们发现，在非远处转移性胃癌患者中ECT2基因高表达组患者较低表达组患者预后好，差异有统计学意义。IGF2基因高表达组患者预后较低表达组患者预后差，差异有统计学意义。

通过构建miRNA-mRNA相互作用的网络图，可以清楚地看到hsa-miR-652-5p、hsa-miR-379-3p和hsa-miR-4521基因与其对应靶基因的关系，miRNA与mRNA结合相互作用，共同调节肿瘤的侵袭、进展。通过继续对这28个靶基因mRNA进行基因通路富集分析，寻找其关联的基因通路，可以为后续的研究指明方向，缩小研究范围。总之，通过本文的研究，我们鉴别出了影响非远处转移性胃癌术后总体生存率的13个差异表达的miRNA，这些miRNA对我们后期的临床研究均有参考意义。我们继续筛选出来了3个独立预后的miRNA(hsa-miR-652-5p、hsa-miR-379-3p、hsa-miR-4521)和其对应的2个对生存有影响的靶基因mRNA(ECT2、IGF2)，这为我们进一步缩小临床检测范围指明了方向，具有很重要的临床意义。

综上，本研究表明，高表达miRNA(hsa-miR-652-5p、hsa-miR-4521)提高非远处转移性胃癌患者术后总体生存率。高表达miRNA(hsa-miR-379-3p)降低非远处转移性胃癌患者术后总体生存率。