泛素化激酶Cbl蛋白对H9N2亚型禽流感病毒早期复制的抑制作用

陈佳静，李彤彤，张则，卢安然，李陈飞，冯秀丽

(南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室/教育部“动物健康与食品安全”国际合作联合实验室，江苏 南京 210095)

法氏囊是禽类中枢体液免疫器官。法氏囊源活性分子发挥了多种功能，如免疫调节[1-3]、促进B细胞分化[4-5]、抗氧化[6]及抗肿瘤[7-8]等功能。前期研究发现，法氏囊源活性分子法氏囊五肽(BPP-I、BPP-IV)来源于同一种蛋白分子，即Cbl(Casitas b-lineage lymphoma)[9]。Cbl蛋白家族是具有Ring Finger结构域的一种泛素化激酶(E3)。哺乳动物细胞中存在3种Cbl亚型，分别为c-Cbl，Cbl-b和Cbl-3[10]。Cbl-b蛋白可以通过充当衔接蛋白来调节细胞活化。在免疫系统中，Cbl-b可通过调节T细胞，B细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)激活途径在抗肿瘤免疫中发挥关键作用[11]。Cbl编码906个氨基酸的多结构域蛋白c-Cbl，其主要功能是调节酪氨酸激酶[12]。c-Cbl是一种120 kDa的蛋白质，包含1个变异的SH2结构域，1个RING结构域，1个富含脯氨酸的区域和1个与泛素(Ub)相关的结构域，与活性血小板衍生的生长因子、表皮生长因子和集落刺激因子-1受体结合并刺激其泛素化[13]。有研究表明，在P-选凝素活化β2整合素的信号通路中，存在有c-Cbl泛素化激酶介导的负反馈调控过程[14]，说明c-Cbl蛋白在炎症反应方面有着精细的调控作用。最近有研究表明，c-Cbl可以作为E3分子调控维甲酸诱导基因I(retinoic acid inducible-gene I, RIG-I)、干扰素调节因子8 (IRF8)等分子泛素化，与细胞Ⅰ型干扰素的产生以及抗病毒反应有密切的关系[15]。

自1992年在中国发现甲型H9N2流感病毒以来，已给家禽养殖业造成了重大的经济损失[16-17]。前期研究发现，重组表达的Cbl能够抑制H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制[18]，说明该蛋白具有一定的抗病毒复制功能。有文献报道，H9N2作为一种临床上常见的AIV亚型，为多种AIV亚型提供了基因片段，具有重要的公共卫生意义[19]。基于此，本研究以人源细胞A549为宿主细胞模型，开展Cbl蛋白表达对H9N2亚型AIV增殖的影响研究。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体及细胞

人肺腺癌细胞(A549)由本实验室保存，采用含有10%胎牛血清1640培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。AIV毒株A/chicken/Shandong/LY1/2017 (H9) 由本实验室于2017年分离、初步鉴定并保存。Cbl siRNA(表1)和阴性对照siRNA购自南京擎科生物科技有限公司。

表1 siRNA序列

1.2 主要试剂

GAPDH单抗，购于Enogene生物公司；HRP标记山羊抗兔IgG二抗，购于优宁维生物公司；DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、核酸内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、Mix、核酸胶回收试剂盒、TRIzol试剂，购于TaKaRa公司；DMEM和胎牛血清(FBS)，购于Gibco公司；蛋白预染Marker、LipofectamineTM3000转染试剂，购于Invitrogen公司；抗流感病毒A核蛋白抗体 (ab20343) 和c-Cbl蛋白抗体(ab32027)，购于Abcam公司。

1.3 Cbl基因的扩增

根据GenBank中Cbl基因(NM_204208.1)的序列设计特异性引物扩增基因，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列为，F：5′-AAGCTTATGTCGGCTCCGCTGAAGAAGGG-3′，R：5′-GAA-TTCTTACAGGGATAACTTCGTCAGGTTACGCCTAGGC-TGAG-3′。

1.4 重组质粒的构建

在50 μL PCR体系中加入反转录后的HD11 cDNA模板2.5 μL，上、下游引物各1 μL，rTaq酶mix 25 μL，补加ddH2O至50 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min，在16 ℃终止反应。PCR结束后，回收PCR产物进行双酶切。酶切体系为：质粒或目的片段1 μg、限制性内切酶各2 μL、10 × Cutsmart buffer 5 μL、ddH2O补至50 μL。37 ℃酶切45 min，65 ℃ 5 min结束酶切反应。清洁回收酶切产物，然后利用T4 DNA连接酶连接。16 ℃连接过夜，取连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄抗性的LB固体平板上37 ℃ 过夜培养。挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定，选取1～3个阳性克隆送南京擎科生物技术有限公司进行测序。

1.5 Western blot检测蛋白表达

A549细胞接种至24孔板中，待其贴壁生长至密度为60%～70%，利用Lip3000转染相应质粒至A549细胞中，其中FLAG-Cbl组转染FLAG-Cbl质粒，FLAG组转染FLAG-N空载体，对照组则仅加入Lip3000转染试剂，转染后6 h更换培养液，用含2%血清的1640培养基，继续培养至24 h。接种感染复数(MOI)为0.1的H9N2亚型病毒，在对应时间点收集细胞沉淀制样，进行SDS-PAGE检测后，转印至PVDF膜，于5%脱脂奶中室温封闭2 h，用PBST洗膜3次，洗膜完成后根据蛋白Marker大小剪取所需蛋白大小的膜至稀释好的对应单抗中，4 ℃孵育过夜。清洗后置于5%脱脂奶稀释的HRP标记山羊抗兔二抗中于37 ℃继续孵育1 h。利用化学发光检测试剂盒进行化学发光显色，检测蛋白表达情况。

1.6 RNA的提取及反转录

采用TRIzol裂解法提取细胞总RNA，并且反转录为 cDNA 模板用于实时荧光定量 PCR，反转录体系为 20 μL：RNA 模板 6 μL；AccuRT reaction mix (4×) 2 μL；AccuRT Reaction Stopper (5×) 试剂2 μL；5× All-In-One RT MasterMix 试剂 4 μL；Nuclease-free H2O试剂6 μL；反应程序为25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，最后85 ℃ 5 min。

1.7 荧光定量PCR设计合成

根据 GenBank上公布的 H9N2 亚型 AIV 的血凝素(HA)、核蛋白(NP)和非结构蛋白(NS)基因序列，设计并且合成荧光定量 PCR引物，如表2所示。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2 荧光定量PCR引物

1.8 荧光定量 PCR反应体系和程序

反应体系: EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10 μL，上下游引物各0.6 μL，模板DNA 2 μL，水6.8 μL。反应程序为预变性95 ℃ 1 min，然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，35个循环，采集信号分析结果。荧光定量PCR试验数据处理采用2-ΔΔCt法。

1.9 转染siRNA

A549细胞接种至24孔板中，待其贴壁生长至密度为30%～40%，利用LipofectamineTM3000转染试剂转染相应siRNA各50 pmol，转染后6 h后更换培养液为含2%血清的1640培养基继续培养36 h。然后接种MOI=0.1的H9N2亚型AIV，分别在感染后不同时间段收集细胞样品，采用荧光定量PCR检测病毒HA基因相对表达水平。

2 结果与分析

2.1 真核重组表达载体 FLAG-Cbl 构建

以禽源HD11细胞的cDNA为模板，扩增出Cbl片段，大小为420 bp (图1) ，与预估大小符合。将扩增产物Cbl与空载体FLAG-N连接后，以单菌落扩增后提取的质粒为模板进行 PCR，琼脂糖凝胶电泳显示，在420 bp处有1条明显条带(图2)，与预期结果一致。PCR阳性质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，发现约3 779和420 bp 2条特异条带，如图3所示。这些结果说明，真核重组表达载体FLAG-Cbl已构建成功。

M.DNA Marker;1～3.Cbl的PCR产物

M.DNA Marker;1～5.FLAG-Cbl的重组载体PCR产物

2.2 Cbl蛋白对H9N2病毒在A549细胞中复制的影响

2.2.1 从蛋白水平上检测Cbl蛋白对病毒复制的影响

FLAG-Cbl 重组载体和FLAG空载体转染A549细胞24 h，然后接种H9N2病毒，分别于6、12、24和36 h后收样，检测不同时间点病毒NP蛋白的表达情况，如图4。结果显示，在接毒6 h后FLAG-Cbl组的NP蛋白表达低于FLAG空载组。该结果表明表达的Cbl蛋白抑制了H9N2 病毒在A549细胞中的早期复制。

M.DNA Marker;1～3.双酶切FLAG-Cbl重组载体

图4 Western blot检测病毒NP蛋白的表达

利用 Image J 软件进行结果分析，分析不同细胞组的NP蛋白与内参蛋白GAPDH蛋白的比值，结果如图5所示。接毒6 h时，FLAG-Cbl组的NP蛋白水平明显低于对照和FLAG组(P<0.05)。接毒12 h时，FLAG-Cbl组的NP蛋白水平也低于对照组，不过没有达到差异水平(P<0.05)。

*表示差异显著(P<0.05)。下同

2.2.2 从mRNA水平上检测Cbl蛋白对病毒复制的影响

FLAG-Cbl重组载体和FLAG空载体转染 A549 细胞24 h，分别于接种H9N2亚型病毒6、12、24和36 h收样，进行荧光定量PCR检测。结果如图6所示，接毒6、12和24 h时，FLAG-Cbl组的病毒NP基因相对水平显著低于对照和FLAG组(P<0.05，P<0.01)，表明重组表达的Cbl蛋白抑制了H9N2亚型AIV在A549细胞中的早期复制。在病毒接种36 h时，FLAG-Cbl组的病毒NP基因相对水平低于FLAG空载体组(P>0.05)，不过极显著高于对照组(P<0.01)。

**表示差异极显著(P<0.01)。下同

同时，采用定量PCR技术检测了H9N2病毒的HA、NS基因表达水平。结果显示，在接毒6和12 h，FLAG-Cbl组的病毒NS基因相对水平明显比FLAG空载体组低(P<0.05，P<0.01)(图7)，且该组的HA基因相对水平明显低于FLAG空载体组(P<0.05)(图8)。在病毒接种24 h时，各试验组的NS和HA基因表达水平差异不大(P>0.05)。在病毒接种36 h时，FLAG-Cbl组的病毒NS和HA基因相对水平低于FLAG空载组，不过高于对照组。

图7 荧光定量PCR检测NS基因相对表达水平

2.3 敲低内源性Cbl蛋白对H9N2病毒增殖的影响

为了探究内源性Cbl蛋白对于H9N2病毒的影响，在A549细胞中分别转染对照和3条靶向Cbl蛋白的siRNA (Cbl-1、Cbl-2和Cbl-3) 敲低Cbl蛋白的表达。转染72 h后，经Western blot和荧光定量PCR验证敲低效率。与对照相比，siRNA-Cbl-1、-2和-3均敲低细胞中Cbl蛋白的蛋白表达及基因表达水平明显减少，其中以siRNA-Cbl-1敲低Cbl蛋白和基因表达最为明显(P<0.05)(图9、10)。

图8 荧光定量PCR检测HA基因相对表达水平

图9 Western blot检测siRNA对Cbl蛋白的敲低作用

***表示差异极显著(P<0.001)。下同

基于上述结果，选择敲低效果最显著的siRNA-Cbl-1进行后续试验。转染siRNA-Cbl-1 36 h后，以MOI=0.1的H9N2病毒感染，分别在感染后 6、12、24和36 h收集细胞样品，做荧光定量PCR验证。结果如图11所示，在A549细胞中敲低Cbl蛋白表达12～36 h时，病毒HA基因水平明显上升(P<0.001)，说明敲低细胞内Cbl时，病毒复制增强，暗示细胞内的Cbl蛋白能够在一定程度上抑制H9N2病毒的复制。

图11 荧光定量PCR检测敲低细胞内Cbl对病毒HA基因表达的影响

3 讨论

H9N2亚型AIV已给我国家禽养殖业造成了巨大的经济损失，并造成了严重的公共卫生安全隐患[16-17]。开展抗AIV的功能机制研究已成为众所关注的重要课题。本研究前期发现，Cbl为法氏囊源活性分子的同源蛋白[9]。Cbl作为一种泛素化激酶(E3)，是细胞内泛素化生物过程的重要组成[20-21]。有研究显示，E3泛素连接酶可通过促进TBK1 泛素化修饰来调控其表达及活化[22]，也可与TRAF3相互结合并对其进行K29泛素化修饰，增强下游信号分子IRF3的活化，从而促进Ⅰ型干扰素的产生来抑制病毒复制[23]。那么，Cbl对H9N2亚型AIV的复制影响如何，有待于进一步探索。

本试验成功构建了FLAG-Cbl真核表达载体，并将其转染至A549细胞中，感染H9N2亚型AIV后，经Western blot和荧光定量PCR检测NP等病毒蛋白的表达情况，发现在病毒感染6和12 h时，FLAG-Cbl转染的细胞中病毒NP、NS和HA基因表达水平均明显低于FLAG组，且低于对照组，这说明Cbl蛋白在H9N2亚型病毒早期复制有一定的抑制作用。同时发现，病毒感染24 h时，FLAG-Cbl转染组、FALG组和对照组细胞中病毒NS和HA基因表达水平相似，而在病毒感染36 h时，FLAG-Cbl转染组细胞中病毒NP、NS和HA基因表达水平均低于FLAG组，但高于对照组。我们推测可能是因为24 h以后，细胞内病毒总量复制增加，Cbl虽然具有一定抑制病毒的能力，但病毒可能通过一些机制仍在不断增加，以至于Cbl蛋白不能充分发挥抑制病毒复制的功能，这些侧面说明了Cbl蛋白仅在病毒早期发挥抑制病毒复制的作用。至于其中的功能机制尚不清晰，还有待深入探索。

HA蛋白是H9N2亚型AIV的重要结构蛋白，不仅介导病毒吸附及穿入宿主细胞，而且是一种保护性抗原[24]。本试验用RNAi技术敲低细胞内Cbl蛋白后，以HA基因水平反映H9N2亚型AIV的入侵宿主细胞及其在宿主细胞中的复制情况。荧光定量PCR检测发现病毒HA基因水平明显增高。这说明细胞内Cbl蛋白降低后，细胞内AIV增多，暗示着细胞内Cbl蛋白降低后，AIV复制增强。该结果与FLAG-Cbl转染过表达的结果具有一定的负相关关系。这也反过来暗示了Cbl蛋白对于H9N2亚型流感病毒复制有一定的抑制作用。郑阳等[18]报道，重组表达的Cbl蛋白能够在犬MDCK 细胞上抑制H9N2亚型AIV的复制。本研究以A549细胞为模型，采用不同的重组表达载体，取得了与此相似的研究结果。这暗示着Cbl能够在不同宿主细胞内发挥抑制H9N2亚型AIV复制的功能。许多研究都证实，E3泛素连接酶家族成员可通过泛素化途径来调控干扰素水平从而影响病毒复制情况[23]。那么，Cbl蛋白抑制AIV早期复制的作用机制是否与其泛素化调节干扰素的功能机制相关，还有待进一步研究。

总之，本研究证实法氏囊源多肽同源蛋白Cbl的重组蛋白能够在人源细胞模型中抑制H9N2亚型AIV的早期复制，为深入研究Cbl蛋白抗病毒复制机制提供了重要的试验依据，同时为开展抗H9N2亚型AIV药物提供了重要参考。