过表达ABAD对Aβ1-42刺激的293T细胞线粒体功能和自噬水平的影响

洪婷婷，张宇，崔理立

广东医科大学 广东省衰老相关心脑疾病重点实验室，广东湛江 524001

淀粉样蛋白结合醇脱氢酶(ABAD)也称17β-HSD10，是一种线粒体蛋白质。已知ABAD有一个LD区域，可特异性与β-淀粉样蛋白(Aβ)结合，Aβ与ABAD形成的复合物导致ABAD结构异常，进而阻止ABAD与NAD+的结合，ABAD不能发挥酶活性，线粒体膜通透性发生变化，进而导致线粒体窘迫和细胞毒性。此外，ABAD可调节线粒体基质中的亲环蛋白D(cypD)，后者可调节线粒体通透性过渡孔的开放。同时，已知人线粒体RNase P是由三种蛋白质(ΜRPP1(线粒体核糖核酸酶P蛋白1)，ΜRPP2(17β-HSD10)和ΜRPP3(Μg2+依赖性核糖核酸内切酶))组成，ABAD是ΜRPP1蛋白稳定表达所必需的，ABAD的突变会引起RNaseP组分活性降低和RNA加工缺陷，导致线粒体功能紊乱[1-3]。

Aβ肽是由α、β和γ-分泌酶水解酶切淀粉样蛋白前体蛋白(APP)所产生的。正常情况下，绝大部分产生的是Aβ40，少量是Aβ42，但后者具有更强的疏水性、聚集性以及神经毒性。Aβ1-42可随年龄依赖性快速生成并积聚，引起神经毒性。研究发现Aβ可聚集在线粒体内，降低呼吸链复合物酶的活性，减少线粒体的耗氧量，增加活性氧的产生，最终导致线粒体肿胀及后续的细胞凋亡[4-5]。线粒体作为机体细胞代谢的能量工厂，通过不断的分裂和融合以为适应生命活动的需要，受损或多余线粒体的清除是维护细胞内环境的关键，线粒体自噬作为选择性自噬的一种类型，是机体清除受损线粒体的重要形式之一[6]。理论上，线粒体功能絮乱，包括膜电位下降、活性氧生成增多、ATP产量减少等，会诱导机体启动线粒体自噬，受损线粒体通过与溶酶体结合，清除受损的线粒体。但目前尚未有ABAD与线粒体自噬的相关报告。本文旨在研究在Aβ1-42刺激下过表达ABAD对293T细胞线粒体功能的影响，并探究其是否影响自噬相关蛋白的水平。

1 材料与方法

1.1 材料 293T细胞(上海中乔新舟生物公司)，血清、胰酶、双抗(美国Gibco公司)，DΜEΜ高糖培养基(美国Gibco公司)，Lipo Fiter(汉恒生物科技有限公司)、BCA蛋白检测盒(美国Thermo公司)，ABAD过表达质粒、ABAD干扰质粒(上海毅乐生物)，增强型ATP(三磷酸腺苷)检测试剂盒、ROS(活性氧)检测试剂盒(碧云天生物技术)，氧化磷酸化解偶联剂CCCP(羰基氰化物间氯苯腙)(ΜCE)，Aβ1-42(β淀粉样蛋白1-42)(上海强耀生物科技有限公司)，DΜSO(二甲基亚砜)(青岛生物科技)，抗体：LC3B(Sigma)，P62、ABAD(Abcam)，β-actin(CST)，低温高速速离心机(德国Eppendorf公司)，酶标仪、化学发光仪(美国Thermo公司)，曝光机(美国Azure Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 293T细胞购买于上海中乔新舟生物公司，使用完全培养基(10%胎牛血清+1%的双抗+高糖培养基)在37℃、5%CO2细胞培养箱传代培养。倒置显微镜下观察细胞，每隔2～3 d传代1次，用含EDTA胰酶消化3 min，加两倍体积培养基终止胰酶消化。传代3次后进行实验。分组方法：(1)Control组、过表达ABAD组、Control给药组(Aβ1-425μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)、过表达ABAD给药组(Aβ1-425μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)；(2)Control组、sh-ABAD组；(3)Control+DΜSO组、Control+CCCP组、过表达ABAD+DΜSO组、过表达ABAD+CCCP组(WT/Aβ10μmol/L)。

1.2.2 细胞转染 严格按照汉恒Lipo Fiter说明书转染。细胞传代3次后，按1×105/孔接种，细胞培养箱中培养24 h，细胞密度在60%左右进行转染。ABAD过表达和sh-ABAD转染终浓度为2μg/孔。转染5～6 h后更换新的培养基继续培养。24 h后，用配制的不同浓度Aβ1-42刺激细胞24 h。

1.2.3 Aβ1-42的配制 Aβ1-42母液配制：取人源Aβ1-42单体，用HFIP重悬，在通风橱中挥发后获得Aβ肽膜，以DΜSO溶解肽膜，稀释至适当浓度后，37℃孵育48 h后即得到Aβ寡聚体，孵育后的溶液1周内使用。

1.2.4 氧化磷酸化解偶联剂CCCP的配制 CCCP母液配制：离心试管，在无菌操作台中称取适量CCCP粉末，加入DΜSO，使浓度为20 mmol/L，充分震荡混匀离心，即得到CCCP母液，1个月内使用。

1.2.5 ATP(三磷酸腺苷)检测 按照产品说明书操作，吸除培养液，100μL裂解液/12孔板每孔，移液器反复吹打,充分裂解细胞。裂解后4℃12 000 g离心5 min，吸取的上清即为样品。按照每个样品/标准品需100μL ATP检测工作液的比例配制适当量的ATP检测工作液。把待用试剂在冰浴上融解。取适量的ATP检测试剂，用ATP检测试剂稀释液稀释ATP检测试剂(1：4)。稀释后的ATP检测试剂即为ATP检测工作液。加100μLATP检测工作液到检测管内，室温放置5 min。检测管内加上20μL样品/标准品，迅速用枪混匀，间隔2 s后用化学发光仪测定RLU值。

1.2.6 活性氧(ROS)检测 按照产品说明书操作，用无血清培养液稀释2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐DCFH-DA(1∶1 000)，使终浓度为10μmol/L。用稀释好的DCFH-DA重悬细胞，细胞浓度控制在100万～2 000万/mL，37℃细胞培养箱中孵育20 min。隔5 min上下颠倒混匀，待探针和细胞充分接触后，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用流式细胞仪检测荧光的强弱。

1.2.7 Western Blot 移除培养液，用冰PBS小心洗一遍，按100μL裂解液/6孔板每孔的比例加入裂解液，置于摇床冰上，裂解15 min，用细胞刮充分刮数下，收集蛋白至EP管。检测细胞浓度(BCA蛋白检测法)。各组样本取相同摩尔质量和体积的蛋白量进行SDS-PAGE电泳(初始电压为60 V，待蛋白条带入分离胶，调整电压至100 V)，预先将PDVF膜泡在甲醇液中5～10 min，待电泳结束，将其转印至PVDF膜，赶走膜和胶之间的气泡，放入转膜槽(200 mA，100 min)，1x TBST稀释的5%脱脂牛奶，摇床上常温封闭1 h。将一抗和膜置于孵育袋中共同孵育(一抗稀释液配制所有的一抗，浓度为1∶1 000)，4℃摇床过夜。回收一抗，1×TBST洗膜3次，10 min/次。二抗用1×TBST稀释的5%脱脂牛奶溶解，与膜在摇床上常温孵育1 h。1×TBST洗膜3次，10 min/次。显色及曝光。采用Image J对Western blot条带进行量化，将归一化后目标蛋白灰度值与内参β-actin灰度值之间比值视为目标蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 所有实验重复至少3次。应用IBΜSPSSStatistics 26对实验结果进行统计分析。计量数据均经过正态性检验，符合正态分布，以均值±标准差(±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 293T细胞过表达ABAD对线粒体功能的影响 为确定在293T细胞中过表达ABAD对线粒体功能的影响，分别测试其ATP、活性氧的变化。如表1所示，过表达ABAD组与Control组相比，ATP的产量和活性氧的生成变化不明显，差异均无统计学意义(P＞0.05)。以上结果表明：ABAD过表达不影响293T细胞线粒体功能。为进一步证实ABAD作为线粒体蛋白在线粒体功能起重要作用，分别测试干扰ABAD后293T细胞的ATP和活性氧的变化。如表2所示，干扰ABAD使293T细胞ATP产生减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但不影响活性氧的生成，差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 293T细胞过表达ABAD线粒体功能比较(±s，n=4)

表1 293T细胞过表达ABAD线粒体功能比较(±s，n=4)

组别Control组ABAD组t值P值ATP 0.983 3±0.047 13 1.021±0.077 44 0.419＞0.05 ROS 0.668 2±0.068 20 0.739 7±0.029 66 0.961＞0.05

组别Control组ABAD组t值P值ATP 13.46±0.333 9 8.274±1.431 0 3.529＜0.05 ROS 0.862 9±0.052 8 0.821 7±0.023 1 0.712 7＞0.05

2.2 不同Aβ浓度刺激下293T细胞过表达ABAD对线粒体功能的影响 为了进一步验证Aβ刺激下，过表达ABAD对线粒体功能的影响，在293T细胞过表达ABAD后加入5μmol/LAβ1-42，分别测试其ATP和活性氧。如表3所示，无论有无Aβ1-42刺激，过表达ABAD的293T细胞ATP产量和ROS产生变化不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)，这可能是Aβ浓度还不足以与ABAD结合，引起其构象改变，因此增添了两个浓度的Aβ1-42，即10μmol/L和20μmol/L。如表3所示，只有在Aβ1-42刺激浓度在10μmol/L时，过表达ABAD组与Control组相比，ATP产量相对减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。这可能是ABAD与Aβ1-42的结合需要一定的浓度范围，浓度范围过低不能竞争结合ABAD，浓度过高，Aβ1-42本身的毒性作用已经足以损害细胞产能。

表3 不同Aβ浓度下各组的线粒体功能比较(±s，n=4)

表3 不同Aβ浓度下各组的线粒体功能比较(±s，n=4)

组别Control组ABAD组t值P值Control+Aβ(5μmol/L)组ABAD+Aβ(5μmol/L)组t值P值Control+Aβ(10μmol/L)组ABAD+Aβ(10μmol/L)组t值P值Control+Aβ(20μmol/L)组ABAD+Aβ(20μmol/L)组t值P值ATP 1.028±0.0456 3 1.072±0.007 340 0.950 7＞0.05 0.855 9±0.037 65 0.891 8±0.034 90 0.699 8＞0.05 0.931 0±0.047 47 0.660 7±0.086 39 2.000 0＜0.05 0.860 3±0.015 10 0.802 6±0.090 60 0.628 5＞0.05 ROS 0.903 2±0.041 02 0.834 6±0.048 14 1.085＞0.05 0.834 6±0.034 86 0.865 6±0.023 09 0.741 7＞0.05 0.7729±0.056 07 0.8437±0.129 0 0.503 4＞0.05 0.896 9±0.014 95 0.879 9±0.054 56 0.299 6＞0.05

2.3 293T细胞过表达ABAD对线粒体自噬蛋白水平的影响 过表达ABAD对线粒体功能无明显影响，且只在Aβ1-42特定浓度下线粒体ATP产生减少。为进一步探究过表达ABAD与线粒体自噬的关系，在293T细胞中过表达ABAD 24 h，再用线粒体自噬诱导剂CCCP 20μmol/L处理6 h，观察线粒体自噬相关蛋白P62和LC3B的蛋白水平。如图1、表4所示，在293T细胞中过表达ABAD，P62蛋白水平下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但LC3B蛋白水平变化不明显，差异无统计学意义，提示正常ABAD过表达可能影响溶酶体，因为P62是溶酶体的标志蛋白。

表4 293T细胞过表达ABAD线粒体自噬相关蛋白P62和LC3B比较(±s，n=6)

表4 293T细胞过表达ABAD线粒体自噬相关蛋白P62和LC3B比较(±s，n=6)

组别Control+DΜSO组ABAD+DΜSO组t值P值Control+CCCP组ABAD+CCCP组t值P值ABAD蛋白1.284±0.141 1 4.795±0.439 8 7.602＜0.05 1.070±0.1683 4.129±0.3662 7.592＜0.05 P62 1.405±0.156 1 1.028±0.044 59 2.322＜0.05 1.289±0.145 2 0.8007±0.068 20 3.042＜0.05 LC3B 1.872±0.261 6 1.812±0.045 39 0.225 1＞0.05 2.550±0.250 0 2.768±0.194 3 0.687 9＞0.05

图1 在CCCP自噬诱导剂诱导下，293T细胞过表达ABAD不引起线粒体自噬发生

2.4 Aβ1-42刺激下293T细胞过表达ABAD对线粒体自噬蛋白水平的影响 只在Aβ1-4210μmol/L诱导下，过表达ABAD可使线粒体ATP的产生减少，因此考虑ATP产生受损是否会诱发线粒体自噬，故在293T细胞中过表达ABAD，加入Aβ1-4210μmol/L 24 h，再加入CCCP诱导剂20μmol/L 6 h，观察线粒体自噬蛋白水平的变化，如图2、表5所示，在Aβ1-42刺激下，CCCP诱导自噬过程中293T细胞过表达ABAD使P62蛋白水平降低、LC3B水平升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，提示过表达ABAD在Aβ1-42刺激下促进线粒体自噬发生。

图2 在Aβ1-42 10μmol/L刺激下，293T细胞过表达ABAD促进线粒体自噬发生

表5 Aβ1-42 10μmol/L刺激下，293T细胞过表达ABAD线粒体自噬相关蛋白P62和LC3B比较(±s，n=6)

表5 Aβ1-42 10μmol/L刺激下，293T细胞过表达ABAD线粒体自噬相关蛋白P62和LC3B比较(±s，n=6)

组别Control+DΜSO组ABAD+DΜSO组t值P值Control+CCCP组ABAD+CCCP组t值P值ABAD蛋白2.618±1.171 33.61±0.994 9 20.17＜0.05 1.524±0.380 8 41.52±1.676 23.27＜0.05 P62 0.698 4±0.043 08 0.576 4±0.034 29 2.216＞0.05 0.762 1±0.052 15 0.618 4±0.021 06 2.554＜0.05 LC3B 0.499 0±0.050 32 0.240 7±0.013 33 4.962＜0.05 0.758 3±0.033 44 0.928 9±0.032 41 3.663＜0.05

3 讨论

ABAD属于羟基甾体脱氢酶家族，在成年人和胎儿大脑海马及杏仁核的神经元中表达最为丰富[7]。在小鼠和爪蟾胚胎的研究发现，胚胎早期丧失ABAD可能是致命的，因为在敲除ABAD基因后小鼠胚胎早期出现了因线粒体功能障碍导致的细胞凋亡和死亡，这意味ABAD在细胞存活中起着重要作用，且研究还发现这种作用独立于其酶的催化活性，可能是其存在为机体提供了某些结构功能，又或者参与维持结构的完整性。另外，研究发现ABAD的LD区域可特异性与Aβ结合，导致ABAD结构异常，不能发挥酶活性，线粒体膜通透性改变，导致线粒体窘迫和细胞毒性。同时，有报道表明，使用ABAD诱骗肽(ABAD-DP)来拮抗Aβ和ABAD的结合能保护神经元线粒体功能，而ABAD与Aβ分离，则能使线粒体、神经元免受Aβ的毒性[8-12]。由上可知，ABAD作为一种线粒体蛋白，在维持线粒体稳态中起着至关重要的作用，而ABAD又能与Aβ相互作用，影响线粒体正常功能发挥。当线粒体功能受损超过一定阈值时，机体则会启动线粒体自噬途径，清除受损线粒体，调节线粒体稳态。

线粒体自噬是各种内外刺激诱发、由自噬囊泡包裹、吞噬受损的线粒体，通过与溶酶体相结合，降解其包裹的内容物的过程。当线粒体遭受轻微刺激时，机体首先启动线粒体融合作用，通过与健康线粒体融合以中和受损线粒体的伤害，但当线粒体损伤超出线粒体融合所承受的范围，则机体将促线粒体进行分裂，把受损部分的线粒体分离，通过线粒体自噬途径清除[13]，其中LC3B和P62是检测自噬通量的两个主要标志物。自噬发生时，新生成的LC3则从胞浆型LC3转变为膜型LC3；P62作为特异性底物，与LC3相互作用，在自噬-溶酶体通路中被降解，通过测量LC3比值和P62水平可评估自噬水平的高低。

目前为止，仅有部分研究探究过表达ABAD与Aβ相互作用对线粒体功能的影响，但少有涉及其线粒体自噬通路机制，本实验旨在为对其进行补充，先在最基本的293T细胞器探究在Aβ存在下，过表达ABAD对线粒体功能的影响及其与线粒体自噬的关系，为后续进一步的实验奠定基础。研究结果表明，在293T细胞中，过表达ABAD并不会影响线粒体功能，而干扰ABAD则只能影响线粒体ATP的生成。仅在10μΜ浓度Aβ1-42刺激下影响线粒体ATP的生成，并促线粒体自噬发生。对所得的研究结果归纳几个猜想：(1)神经元是高需能场所，更易受Aβ聚集的破坏。Aβ1-42对293T细胞产生的毒性作用亚于神经元细胞；(2)ABAD作为线粒体成分，但其含量较小，其与Aβ的结合仅些微改变线粒体功能；(3)考虑到线粒体功能受损影响功能可能存在次序，而非同步出现，轻微的损伤只影响ATP的生成，而活性氧产生可能是后期受损严重的结果；(4)线粒体严重受损才能诱发线粒体自噬，CCCP诱导剂本身也是具备毒性作用，加上ABAD与Aβ的相互作用产生的毒性作用，才足以破坏线粒体，促使线粒体自噬发生。

综上所述，ABAD作为线粒体成分的重要一员，其过表达并不影响293T细胞的线粒体功能，但在特定浓度Aβ1-42刺激下发生相互作用，减少线粒体ATP生成，促进线粒体自噬发生。本次研究尚有很多不足之处，如线粒体功能及线粒体自噬检测方式多样，细胞器的选择及补充等，相关的实验还需进一步探究以明确ABAD与Aβ的结合影响线粒体功能及自噬这一机制。