胃癌合并Hp-L感染患者MIF、MMP-9、VEGF和炎症因子的表达水平及临床意义

侯静芳，杨华，王进海

1.西安交通大学第二附属医院消化科，陕西 西安 710004；2.西安市第一医院老年消化科，陕西 西安 710002

胃癌是临床上常见的恶性肿瘤，主要发生于胃黏膜上皮，幽门螺杆菌(Hp)感染是该病发生的重要危险因素，据数据显示，约有60%的胃癌患者合并Hp感染[1]。幽门螺杆菌L型(Hp-L)是Hp的一种变异类型，拥有更强大的致癌作用，也是导致胃癌侵袭、转移的重要因素，可明显加剧病情恶化速度[2]。早期了解胃癌患者Hp-L感染发生的危险因素在判断病情严重程度、指导治疗方面有重要意义。巨噬细胞移动抑制因子(ΜIF)在促进肿瘤进展方面作用关键，参与着正常细胞的分裂、癌基因所诱导的恶性转化过程[3]。基质金属蛋白酶-9(ΜΜP-9)对基底膜及细胞外基质中的IV型胶原具有降解作用，可促进新生血管生成，导致肿瘤细胞浸润、转移；血管内皮生长因子(VEGF)作为重要的促内皮细胞分裂、促血管生成因子，参与着肿瘤的发生发展过程[4]。此外，胃黏膜炎症在胃癌的恶化过程中也占据着重要地位，炎症反应越重则可能提示Hp感染程度越重[5]。因此，本研究通过观察ΜIF、ΜΜP-9、VEGF及炎症因子在胃癌合并Hp-L感染患者中的表达水平，并探讨其临床意义。现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年2月至2019年2月西安交通大学第二附属医院收治的172例胃癌患者进行研究。纳入标准：①符合胃癌诊断标准，并通过组织病理学检查确诊[6]；②具有胃癌组织标本以及距离癌组织边缘＞5 cm的正常胃黏膜组织标本；③初次接受诊断确诊，既往未接受过相关抗癌治疗。排除标准：①近1个月内使用过质子泵抑制剂、免疫调节剂、抗Hp感染治疗等；②合并其余急慢性感染性疾病；③合并出血性疾病；④合并其余恶性肿瘤或者重大躯体疾病；⑤妊娠期哺乳期。172例患者中男性101例，女性71例；年龄43～76岁，平均(63.40±7.52)岁。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有受试者均知情并签署同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 Hp-L感染检测 将胃癌组织、癌旁组织标本进行常规石蜡包埋切片，结晶紫初染30 s，洗涤，碘液复染1 min后，视野95%乙醇脱色，时间30 s，再次洗涤，稀释，复红复染，时间2 min；再次洗涤，使用中性树胶予以封片，革兰染色油镜下观察，放大倍数10×100，随机观察10～15个不同的视野并计算数量，最终结果取平均数，阳性标准细菌L型、Hp均数≥20，阴性标准为＜20或者无L型和Hp阴性[7]；并进行免疫组化(SP)染色，工作浓度1∶80，将磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为阴性对照，已知的阳性切片作为阳性对照，抗Hp-L抗体购于蚌埠医学院微生物教研室；观察显示胃癌细胞、间质巨噬细胞的细胞质或者胞膜中有棕黄色颗粒表达，则判定为Hp-L阳性；当革兰染色、SP染色检查结果均显示为阳性，则最终判定为Hp-L感染[7]。

Hp-L感染程度的判定方式[7]：在显微镜下，对胃黏膜黏液层、小凹上皮、表面上皮、腺管上皮表面的L型和Hp情况进行观察，轻度为：L型和Hp表达少量，仅偶尔发现或者不到标本组织长度的30%；中度：L型和Hp的表达呈连续、稀薄性，在上皮表面有分布，或者到达标本组织长度的31%～60%；重度：L型和Hp的表达量多，已到达标本组织长度的60%以上。

1.2.2 ΜIF、ΜΜP-9、VEGF检测 ΜΜP-9、抗ΜIF、VEGF单克隆抗体均由武汉博士德公司提供，SP试剂盒由福州迈新该公司提供；采用免疫组化法检测ΜIF、ΜΜP-9、VEGF阳性率情况，具体方式如下：将切除的胃癌组织、癌旁组织经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，进行4μm连续性切片，SP试剂盒染色，使用柠檬酸缓冲液进行煮沸修复，二氨基联苯胺法显色，再使用苏木素复染，将PBS作为阴性对照，已知的阳性切片作为阳性对照；ΜIF、ΜΜP-9、VEGF的表达均定位在细胞质，根据细胞质类的染色强度、阳性细胞数量进行综合评价，染色强度无染色则记0分、淡黄色则记1分、棕黄色则记2分、棕褐色则记3分，阳性细胞数量＜5%则记0分、5%～25%则记1分、26%～50%则记2分、＞50%则记3分，将两者结果相加，总分≥3分则判断为阳性，＜3分则判断为阴性[7]。

1.2.3 血清炎症因子检测 收集所有患者清晨空腹静脉血3 mL，室温下静置1 h后上离心机离心，转速3 000 r/min，时间10 min，提取上层清液储存于-80℃的冷冻箱中待检。检测指标包括白细胞介素(IL)-6和IL-1β，试剂盒均购于深圳晶美生物工程有限公司。检测方式如下：使用IL-6、IL-1β抗体包被酶标板，洗去游离部分后，加入经过辣根过氧化物酶(HRP)所标记的抗人IL-6、IL-1β抗体，洗去游离部分，加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TΜB)进行显色，在HRP的催化下，TΜB显示出蓝色后，加入终止液，使用酶标仪对吸光度进行测量，并计算血清IL-6、IL-1β浓度的表达。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，相关性采用Pearson相关分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织和癌旁组织中Hp-L感染阳性率比较 胃癌组织中Hp-L感染阳性率为69.19%，明显高于癌旁组织的12.21%，差异具有统计学意义(χ2=115.678，P＜0.05)。

2.2 胃癌Hp-L感染阳性和阴性患者ΜIF、ΜΜP-9、VEGF表达阳性率比较 胃癌Hp-L感染阳性患者ΜIF、ΜΜP-9、VEGF表达阳性率明显高于Hp-L阴性患者，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 胃癌Hp-L感染阳性和阴性患者的MIF、MMP-9、VEGF表达阳性率比较(例)

2.3 胃癌Hp-L感染阳性和阴性患者血清炎症因子比较 胃癌Hp-L感染阳性患者血清IL-6、IL-1β的表达水平明显高于Hp-L阴性患者，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 胃癌Hp-L感染阳性和阴性患者血清炎症因子比较(±s，pg/mL)

表2 胃癌Hp-L感染阳性和阴性患者血清炎症因子比较(±s，pg/mL)

组别Hp-L感染阳性Hp-L感染阴性t值P值例数119 53 IL-1β 28.31±3.42 14.07±2.31 27.614＜0.05 IL-6 25.05±3.71 16.23±2.04 16.232＜0.05

2.4 不同Hp-L感染程度患者ΜIF、ΜΜP-9、VEGF及炎症因子表达水平比较 119例Hp-L阳性感染患者中轻度感染27例，中度感染56例，重度感染36例。重度感染患者的ΜIF、ΜΜP-9、VEGF表达阳性率及血清IL-6、IL-1β水平明显高于中度和轻度感染患者，中度感染患者上述结果均明显高于轻度感染患者，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 不同Hp-L感染程度患者MIF、MMP-9、VEGF及炎症因子表达水平比较

2.5 Hp-L感染阳性与ΜIF、ΜΜP-9、VEGF及炎症因子水平的相关性 经Pearson相关性分析结果显示，Hp-L感染阳性与ΜIF、ΜΜP-9、VEGF、IL-6、IL-1β均呈正相关(P＜0.05)，见表4。

表4 Hp-L感染阳性与MIF、MMP-9、VEGF及炎症因子水平的相关性

3 讨论

Hp常定位于胃黏膜，是导致胃癌发生的重要危险因素，Hp-L是其中的一个变异类型，主要生成于不利于Hp生长的条件之中，即便是在消除相关风险因素后，Hp-L型仍可能持续存在并产生毒性作用，和原菌Hp相比，更具有侵袭性、黏附性和威胁性，且其会持续性的对胃黏膜上皮细胞造成损伤，加速胃癌的进展[8]。

ΜIF的分泌主要来自T淋巴细胞、单核巨噬细胞等，关于其在恶性肿瘤中的作用近年来也备受学者重视；目前的研究发现，ΜIF在诸多肿瘤中均具有更高表达，且可促进肿瘤细胞增殖、分裂、血管生成等，导致病情进展[9]。另也有报道指出，在胃炎、肠上皮化生的胃黏膜、胃癌组织中均能检测出ΜIF的表达，且表达趋势呈逐渐递增表现[10]。ΜΜP-9是ΜΜPs家族的重要成员，在体内被激活后可生成Ⅳ型胶原酶，并对肿瘤表面细胞外基质中的Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白造成破坏，加速肿瘤向周围组织的浸润和转移，且其对血管基底膜具有降解作用，可促进内皮细胞迁移，从而导致新生血管形成[11]。VEGF可在血管内皮细胞中发生特异性的作用，主要可促进内皮细胞增殖，是机体血管形成的重要标志物，其表达的升高可加速肿瘤细胞生长[12]。此外，在胃癌的发生、发展过程中，由于肿瘤细胞会对周围正常细胞造成损伤，也会加重机体的炎症反应过程[13]。IL-6、IL-1β均是机体重要的炎性介质，在炎症信号的刺激下，其表达和发生迅速性的升高，对其的评估有助于判断机体炎症状态。

本研究结果显示，胃癌组织中Hp-L感染阳性率为69.19%，明显比癌旁组织要高，和陈聪英等[14]结果具有相似性。而在胃癌Hp-L感染阳性患者中ΜIF、ΜΜP-9、VEGF的阳性率及血清IL-6、IL-1β的表达更高，随着Hp-L感染程度的加重，这种表达情况更加明显。在本研究的相关性分析中显示，Hp-L感染阳性和ΜIF、ΜΜP-9、VEGF、IL-6、IL-1β均呈正相关，通过分析是由于，①Hp-L感染可生成细胞毒素相关蛋白(CagA)、空泡毒素(VacA)等具有毒性的因子，直接在胃黏膜产生作用，加重胃黏膜上皮的损伤程度，促使细胞基因发生突变；YULIZAL等[15]研究显示，CagA可刺激ΜIF的分泌增加；加上在恶性肿瘤患者中，随着体内T淋巴细胞、单核巨噬细胞的增加，也同样会加剧ΜIF的释放，而随着ΜIF的增加，又会激活机体发生炎症反应，此过程可形成一种恶性循环，逐渐导致感染程度加重。②胃癌患者发生Hp-L感染后机体会出现慢性炎症表现，增加血清IL-6、IL-1β的表达，并持续性的损伤胃黏膜造成损伤，随着感染程度的加重，可导致组织发生水肿，压迫到毛细血管，造成局部组织缺氧，此过程会导致VEGF表达的明显增加，加速内皮细胞生成，继而又增加ΜΜP-9的大量分泌，各因素之间相互协同、相互促进。但本研究也有不足，例如未观察上述指标和胃癌患者临床病理之间的关系等，此后也将持续深入探讨。

综上所述，ΜIF、ΜΜP-9、VEGF、IL-6、IL-1β水平与胃癌Hp-L感染阳性均呈正相关，且随着感染程度的加重表达越高。