西格列汀对人胰淀素转基因小鼠血糖的干预研究

张强，张曾，杨宏杰，何燕铭

上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院内分泌科，上海 200437

胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能持续衰竭是2型糖尿病(T2DΜ)主要的病理缺陷。其中β细胞凋亡是胰岛功能衰竭的主要因素[1]，因此抑制β细胞凋亡是改善胰岛功能的关键。西格列汀是目前用于治疗2型糖尿病最常用DPP-4酶抑制剂，目前研究表明其可延缓及抑制β细胞凋亡的作用[2-5]。胰淀素(islet amyloid-like polypeptide，IAPP)又名胰岛淀粉样多肽，是一种由37个氨基酸残基组成的多肽，储存在胰岛β细胞的分泌颗粒中，与胰岛素同时分泌。哺乳类、人、灵长类和猫的胰淀素会形成胰岛淀粉样蛋白变性纤维，啮齿类的胰淀素则不能。在高糖刺激、氧化应激等病理状态下，人IAPP(human IAPP，hIAPP)可自我折叠、变性、聚集，其蛋白质二级结构由α螺旋转变为β折叠形成寡聚体[6]，hIAPP寡聚体可进一步诱导胰岛β细胞的凋亡，促使胰岛功能衰竭和血糖异常[7-8]。本研究旨在探讨西格列汀对人胰淀素转基因小鼠(hIAPP-Tg)糖尿病模型是否有改善血糖作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要材料 两对hIAPP-Tg小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ΜE，USA)；8只SPF级健康雄性C57BL/6小鼠，质量(20±2)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；西格列汀(100 mg/片)购自美国默沙东公司；胰岛素及糖化血红蛋白ELISA试剂盒(X-Y Biotechnology，上海，中国)；小鼠胰岛素抗体(Abcam，Cambridge，UK)、CHOP抗体(CST，Boston，USA)；便携式血糖仪及试纸(拜安捷，拜尔，德国)。

1.2 动物分组及给药 hIAPP-Tg小鼠交于上海南方模式科技有限公司代为繁殖鉴定，与C57BL/6小鼠杂交、通过剪尾、RT-PCR及real-time PCR法获得F3代18只hIAPP高表达阳性小鼠(雄性、8周龄)，随机分为模型组和西格列汀组(20 mg/kg)各9只；对照组8只C57BL/6小鼠(雄性、8周龄)；对照组及模型组给予磷酸盐缓冲液(PBS)，西格列汀组给予西格列汀20 mg/kg。根据体质量(1 mL/100 g)给予灌胃，隔天一次，连续给药10周，每两周用便携式血糖仪测鼠尾末梢空腹血糖一次并测量体质量。

1.3 生化及组织病理实验 给药结束后所有动物禁食过夜，并在戊巴比妥麻醉下(腹腔注射100 mg/kg)，然后处死。处死后取血清、用ELISA法检测胰岛素及糖化血红蛋白水平；同时取胰腺组织、称重并立即在液氮中冷冻。取少许组织固定在4%(wt/vol)磷酸盐缓冲的多聚甲醛中并用石蜡包埋，免疫荧光法检测胰岛素及C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达。

1.4 观察指标 每两周测定各组小鼠空腹血糖及体质量；试验结束后检测各组胰岛素及糖化血红蛋白水平，免疫荧光检测胰腺胰岛素及CHOP表达变化。

1.5 统计学方法 数据采用统计软件SPSS19.0进行分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 西格列汀对hIAPP-Tg小鼠空腹血糖及体质量的影响 与对照组比较，模型组及西格列汀组空腹血糖在8周龄时开始明显升高并随饲养时间逐渐升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，西格列汀治疗后空腹血糖呈下降趋势，在给药第10周后空腹血糖较模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1；模型组及西格列汀组体质量较对照组低，但各组间差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表1 各组小鼠间空腹血糖比较(±s，mmol/L)

表1 各组小鼠间空腹血糖比较(±s，mmol/L)

注：与对照组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05。

组别对照组模型组西格列汀组F值P值例数899 0周5.65±0.41 8.18±2.62a 8.09±1.94 4.559 0.021 2周7.63±1.06 11.70±3.60a 11.32±5.00 3.111 0.064 4周5.23±0.27 8.89±3.04a 8.41±4.27 3.449 0.049 6周5.85±0.71 11.16±5.87a 10.18±3.14 4.268 0.027 8周5.68±0.80 11.06±5.00a 10.37±4.65 4.342 0.025 10周5.5±0.31 13.34±4.19a 9.50±3.21b 13.44 0.000

表2 各组小鼠间体质量比较(±s)

表2 各组小鼠间体质量比较(±s)

注：与对照组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05。

组别对照组模型组西格列汀组F值P值例数899 0周24.01±0.74 24.48±1.14a 23.52±1.35 1.638 0.216 2周25.89±1.27 25.69±2.00a 24.39±2.09 1.703 0.204 4周26.58±0.88 25.88±2.74a 24.32±2.69 2.138 0.141 6周27.39±1.08 25.76±3.55a 25.06±3.40 1.366 0.275 8周28.16±1.18 25.56±3.93a 25.48±4.04 1.693 0.206 10周28.64±1.35 25.74±4.17a 25.97±4.46 1.593 0.225

2.2 西格列汀对hIAPP-Tg小鼠空腹胰岛素及糖化血红蛋白的影响 与对照组比较，模型组及西格列汀组血清胰岛素水平降低、西格列汀给药10周后血清胰岛素水平较模型组升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与对照组比较，模型组及西格列汀组糖化血红蛋白升高、西格列汀给药10周后糖化血红蛋白较模型组下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

组别对照组模型组西格列汀组F值P值例数899空腹胰岛素(mIU/L)9.41±1.06 3.57±0.95a 6.61±1.74b 42.683＜0.01糖化血红蛋白(nmol/L)1 104.67±281.96 2 512.68±396.17a 1 525.73±398.01b 33.787＜0.01

2.3 西格列汀对hIAPP-Tg小鼠胰腺胰岛素及CHOP表达影响 与对照组比较，模型组胰腺胰岛素表达明显下降，经西格列汀治疗10周后西格列汀组胰岛素水平较模型组有所升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与对照组比较，模型组胰腺CHOP表达明显升高，与模型组比较经西格列汀治疗10周后CHOP明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4和图1。

表4 西格列汀对hIAPP-Tg小鼠胰腺胰岛素及CHOP表达的影响(±s)

表4 西格列汀对hIAPP-Tg小鼠胰腺胰岛素及CHOP表达的影响(±s)

注：与对照组比较，a P＜0.01；与模型组比较，b P＜0.05；与模型组比较，c P＜0.01。

组别对照组模型组西格列汀组F值P值例数899胰岛素积分光密度(sum)3 595.55±1 831.12 98.22±21.34a 411.27±163.32c 13.295 0.002 CHOP积分光密度(sum)3 115.42±1 314.956 1 3719.46±4 613.05a 5 612.83±1 820.92b 14.009 0.002

图1 hIAPP-Tg小鼠胰腺胰岛素及CHOP免疫荧光结果，西格列汀可提高胰岛素表达及抑制CHOP表达

3 讨论

糖尿病是一种慢性代谢性疾病，大多数患者在第一次接受治疗前就已经出现胰岛β细胞分泌功能缺损情况，并随着时间的推移患者胰岛β细胞分泌功能进行性下降，因此选择既能降糖且能有效抑制胰岛β细胞功能衰退的药物成为研究重点。西格列汀为DPP-4酶抑制剂，可抑制DPP-4活性、提升GLP-1水平、增加葡萄糖摄取、降低肝糖原的输出与生成，可有效降低患者血糖水平，已得到临床广泛应用[9]。hIAPP-Tg小鼠模型为常用的糖尿病动物模型，既往研究表明雄性纯合子小鼠在8周龄时可自发出现糖尿病表型，杂合子及雌性表型不稳定[10]。

本研究结果显示，在8周龄时模型组及西格列汀组的空腹血糖较对照组明显升高，说明hIAPP高表达雄性小鼠8周龄时可自发为糖尿病小鼠模型，与文献研究一致[10]。经西格列汀治疗10周后，hIAPP-Tg小鼠空腹血糖及糖化血红蛋白得到明显改善，说明西格列汀对人胰淀素致糖尿病模型有降低血糖作用；其次、模型组及西格列汀组空腹胰岛素水平及胰腺胰岛素表达明显减少，说明人胰淀素可导致小鼠胰岛功能的下降，经西格列汀治疗10周后hIAPP-Tg小鼠胰岛功能得到一定改善。

适当的内质网应激(ERS)可恢复内质网内的稳态环境，维持细胞存活，是细胞的一种自我保护机制，但强烈持久的应激反应会导致内质网功能紊乱，进一步导致细胞凋亡通路的激活[11]。胰岛β细胞内发生的ERS就是β细胞凋亡的主要途径之一[12]。胰岛淀粉样蛋白沉积是2型糖尿病的重要特征之一。研究表明，胰淀素作为胰岛淀粉样蛋白沉积的主要成分可通过多种机制引起β细胞凋亡[13]，其中ERS在胰淀素导致β细胞凋亡中起重要作用[14]。在病理状态下，IAPP毒性寡聚体的异常聚集，激活内质网跨膜蛋白IRE1α、PERK及ATF6，引发内质网应激反应，并进一步通过CHOP及C-Jun氨基末端激酶(JNK)途径诱导β细胞的凋亡，加速胰岛功能的衰竭[15-16]。

CHOP广泛表达于哺乳动物机体细胞，其编码的蛋白与多种细胞功能活动(如增殖、分化、凋亡等)相关[17]。CHOP由ERS诱导并在生长停止和细胞死亡中起作用，CHOP表达升高是ERS的标志，它在ERS和细胞凋亡的联系中起到重要作用，是一个举足轻重的中间信号分子，可通过多种途径诱导细胞凋亡。

本研究结果显示，与对照组比较、模型组及西格列汀组CHOP表达明显升高，说明人胰淀素在胰腺异常聚集可诱导ERS继而激活CHOP的表达，经西格列汀治疗10周后CHOP表达有所下降，说明西格列汀可减少人胰淀素过表达引起的ERS。

综上所述，西格列汀是目前临床上常用的降糖药物，在hIAPP-Tg糖尿病小鼠模型中同样有降糖及保护胰岛功能的作用，其可能的机制是西格列汀可通过抑制人胰淀素异常聚集诱导的ERS减少β细胞凋亡，具体机制有待进一步研究。