洋甘菊提取物对多囊卵巢综合征大鼠子宫内膜组织、胰岛素抵抗、瘦素和血脂水平的影响

陈书程，陈 炯，郦特军，郑林燕，姚 瑶，王彩霞*

0 引言

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是常见的内分泌疾病，影响了10%～25%的育龄妇女[1]，目前尚不清楚其病因和发病机制。近年来，胰岛素抵抗在PCOS的发展中也发挥了作用。由于雄激素水平升高，PCOS患者的卵泡生成受损，可能出现月经不调、多毛症、痤疮、脱发、不育或反复流产[2]。研究表明，PCOS患者的睾丸激素和黄体生成素浓度较高[3]。此外，大多数PCOS患者的肥胖和胰岛素抵抗指数风险较高[4]。洋甘菊是南欧和东欧最常见的药用植物之一，其主要活性成分包括酚类、类黄酮和植物雌激素[5-6]。洋甘菊提取物(Chamomile extract)具有抗炎、抗氧化、抗肝毒性、抗病毒、保护血管和解痉作用[7]。本研究观察洋甘菊提取物对多囊卵巢综合征大鼠的子宫内膜组织、胰岛素抵抗和瘦素、血脂水平的影响，进一步探讨其作用机制，为临床治疗多囊卵巢综合征提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 60只成年雌性Wistar大鼠(SPF级，180～200 g)购自重庆医科大学实验动物中心[实验动物许可证号:SCXK(渝) 2019-0004]。实验大鼠饲养于标准动物房中，自由饮食和进水，实验动物设计严格经过我院伦理委员会审查。大鼠适应环境2周后进行实验。

1.1.2 试剂 洋甘菊提取物(HPLC≥98%)购自南京道斯夫生物科技有限公司，人绒毛促性腺激素(HCG)购自丽珠集团丽珠制药厂，胰岛素购自武汉优尔生科技有限公司，黄体生成素、卵泡刺激素、睾丸激素、孕酮和雌二醇放射免疫分析试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，胰岛素放射免疫分析试剂盒购自北京原子能生物研究所，瘦素、三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白试剂盒购自深圳依诺金生物科技有限公司，HE染色试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多囊卵巢综合征大鼠模型制备 按照文献[8]进行造模，每只大鼠皮下注射HCG 30 U，每日1次，共22 d；同时每天注射1次胰岛素，第1～11天皮下注射0.5 U，之后逐渐增加剂量为6.0 U，并按此剂量维持至第22天。每天药物注射结束后，进行阴道涂片检查，连续20 d，若大鼠完全失去动情周期性变化，提示造模成功。

1.2.2 分组及给药 ①分组：Wistar大鼠分为4组，假手术组(sham组)、多囊卵巢综合征组(PCOS组)、洋甘菊提取物低剂量组(PCOS+CHA-L组)和洋甘菊提取物高剂量组(PCOS+CHA-H组)，每组15只，除sham组外,其余3组进行造模。PCOS组、PCOS+CHA-L组和PCOS+CHA-H组大鼠按“1.2.1”进行PCOS模型制作，sham组在相同时间皮下注射无菌生理盐水，共22 d。选取造模成功的大鼠进行后续实验。②给药方式：灌胃；给药时间：造模结束后1 d，连续给药30 d；给药次数：1次/d。sham组：生理盐水，4 ml/kg；PCOS组：生理盐水，4 ml/kg；PCOA+CHA-L组：45 mg/kg的洋甘菊提取物，给药体积为4 ml/kg；PCOS+CHA-H组：75 mg/kg的洋甘菊提取物，给药体积为4 ml/kg。

1.2.3 取材 末次给药2 h后，大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉。待麻醉后，称取大鼠体重，并于腹主动脉取血，置于离心管中，3 000 r/min 离心15 min，吸取上层血清，于-80 ℃冰箱保存。摘除子宫组织，称取子宫组织的重量，并于4%多聚甲醛溶液中固定；摘取胰腺组织，测量胰腺组织最宽和最窄部分取平均值，获得胰岛的直径，并于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.4 血清样本的检测 取出-80 ℃保存的血清，置于冰上溶解。采用放射免疫分析法测定各组大鼠血清黄体生成素、卵泡刺激素、睾丸激素、孕酮和雌二醇的表达水平；采用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖的表达水平；采用放射免疫分析法测定胰岛素的表达水平，并根据公式计算胰岛素抵抗指数；ELISA法检测血清中瘦素、三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的表达水平。

1.2.5 HE染色 取子宫组织和胰腺组织，并将其固定在4%多聚甲醛溶液中，在乙醇中脱水，二甲苯中透明，并制成5 μm的石蜡切片。切片放入苏木素染液中5 min，自来水清洗后，置于1%的盐酸酒精分化数秒，并用流水冲洗。切片放入伊红染液中染色3 min，流水稍洗。之后切片置于梯度酒精中脱水，各5 min，再放入二甲苯I、II中透明，分别5 min。将切片取出，用滤纸轻轻拭干切片上残余的二甲苯，在组织上滴加中性树胶封片，使用莱卡显微镜进行拍摄。

2 结果

2.1 洋甘菊提取物对各组大鼠体重和子宫指数的影响 如表1所示，与sham组相比，PCOS组大鼠体重和子宫指数明显升高(P<0.01)；与PCOS组相比，PCOS+CHA-L组和PCOS+CHA-H组大鼠的体重和子宫指数下降(P<0.05)。

表1 各组大鼠体重和子宫指数的变化(n=15)

2.2 洋甘菊提取物对各组大鼠血清中促性腺激素和性激素表达的影响 如表2所示，与sham组相比，PCOS组大鼠血清中黄体生成素表达水平和睾丸激素表达水平显著上升(P<0.001)，卵泡刺激素表达水平和雌二醇表达水平明显下降(P<0.01，P<0.05)；与PCOS组相比，PCOS+CHA-L组和PCOS+CHA-H组大鼠血清中黄体生成素表达水平和睾丸激素表达水平下降(P<0.05)，卵泡刺激素表达水平和雌二醇表达水平上升(P<0.05)。

表2 各组大鼠血清中促性腺激素和性激素的表达水平(n=15)

2.3 洋甘菊提取物对各组大鼠子宫组织病理变化的影响 大鼠子宫组织的病理学观察见图1，sham组中，子宫内膜腺体正常，乳头状排列，被单层柱状上皮覆盖；细胞核排列整齐，未见核固结或核碎裂。PCOS组中，子宫内膜腺体增生，镜下可见假塑性柱状上皮，细胞核突出但大部分为碎片，在视野中可以看到炎性细胞如嗜中性粒细胞；PCOS+CHA-L组中，子宫内膜腺体轻度增生，腺体多为乳头状和管状，细胞核排列整齐，但核仁不明显，可见少量炎症细胞；PCOS+CHA-H组中，子宫内膜腺体正常，乳头状排列，未见炎性细胞。

图1 HE染色观察各组大鼠子宫组织的病理变化(200×)

2.4 洋甘菊提取物对各组大鼠胰岛组织病理变化的影响 大鼠胰岛组织的病理观察见图2，在sham组中，大鼠胰岛组织的形状和结构正常，并且细胞以紧凑和有序的方式排列；在PCOS组中，胰岛组织出现异常病变，细胞排列疏松；与PCOS组相比，PCOS+CHA-L组和PCOS+CHA-H组大鼠胰岛组织形态和结构趋于正常，细胞排列紧密。

图2 HE染色观察各组大鼠胰腺组织的病理变化(200×)

2.5 洋甘菊提取物对各组大鼠胰岛素、葡萄糖表达水平和胰岛素抵抗指数的影响 如表3所示，与sham组相比，PCOS组大鼠血清胰岛素含量、葡萄糖含量和胰岛素抵抗指数明显升高(P<0.01，P<0.05，P<0.01)；与PCOS组相比，PCOS+CHA-L组和PCOS+CHA-H组大鼠血清胰岛素含量、葡萄糖含量和胰岛素抵抗指数降低(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。

表3 各组大鼠胰岛素、葡萄糖表达水平和胰岛素抵抗指数的变化(n=15)

2.6 洋甘菊提取物对各组大鼠血清瘦素水平的影响 如表4所示，与sham组相比，PCOS组大鼠血清瘦素水平增加(P<0.05)；与PCOS组相比，PCOS+CHA-L组和PCOS+CHA-H组大鼠血清瘦素水平下降(P<0.05)。

表4 各组大鼠血清瘦素水平的变化(n=15)

2.7 洋甘菊提取物对各组大鼠血脂的影响 如表5所示，与sham组相比，PCOS组大鼠三酰甘油、胆固醇和低密度脂蛋白的含量明显增加(P<0.01，P<0.01，P<0.001)，高密度脂蛋白含量明显下降(P<0.01)；与PCOS组相比，PCOS+CHA-L组和PCOS+CHA-H组大鼠三酰甘油、胆固醇和低密度脂蛋白的含量明显下降(P<0.05)，高密度脂蛋白含量增加(P<0.05)。

表5 各组大鼠血脂水平的变化(n=15)

3 讨论

西医认为，遗传因素、高黄体生成素、糖脂代谢异常、高胰岛素血症和胰岛素抵抗、高雄激素血症、低度炎症反应、肥胖、卵巢功能异常和青春期过度是PCOS的病因和发病机制[9-11]。

洋甘菊为菊科母菊属德国洋甘菊，为菊科植物洋甘菊干燥的花或全草。洋甘菊具有降低血压、降低胆固醇、发汗通便等功效[12]。研究发现，洋甘菊提取物对小鼠有降血糖作用，并且能改善小鼠糖耐量，可用于临床治疗糖尿病[13]。本研究发现，洋甘菊提取物可使大鼠的体重和子宫指数下降，黄体生成素表达水平和睾丸激素表达水平下降，卵泡刺激素表达水平和雌二醇表达水平上升；也可使子宫内膜腺体正常，乳头状排列，炎性细胞减少，也使胰岛组织形态和结构趋于正常，细胞排列紧密。

胰岛素抵抗在PCOS中发挥着重要作用，其中大约有45%～65%的患者均存在不同程度的胰岛素抵抗，且PCOS患者患有2型糖尿病的风险显著增加[14]。研究显示，黄酮类(如洋甘菊提取物)化合物具有降糖、改善胰岛素抵抗、抑制相关葡萄糖代谢酶活性和抗糖尿病氧化损伤等作用[15]。本研究发现，PCOS组大鼠血清胰岛素含量、葡萄糖含量和胰岛素抵抗指数明显升高，而洋甘菊提取物使大鼠血清胰岛素含量、葡萄糖含量和胰岛素抵抗指数降低，与上述文献报道一致。

瘦素是一种由OB基因编码的脂肪细胞衍生的激素，对啮齿动物的生殖功能有重要影响。循环中的瘦素水平与肥胖症直接相关，而肥胖症通常与PCOS有关，高胰岛素血症和胰岛素抵抗通常与瘦素及其受体有关[16]。Rizk等[17]研究发现，PCOS与瘦素水平升高有关，表明了瘦素在PCOS发病机制中的作用。潘爱珍[8]等研究发现，苍附导痰汤可通过降低体重、增加胰岛素敏感性、调节瘦素、脂联素和生殖激素的水平，从而改善大鼠生殖功能。本研究发现，洋甘菊提取物能降低胰岛素抵抗指数，PCOS组大鼠血清瘦素水平增加，洋甘菊提取物使大鼠血清瘦素水平下降。

研究发现，PCOS患者同时患有高血压和血脂异常的频率明显增加[18]，另一项研究中发现，患有PCOS的女性比健康女性的冠状动脉疾病发生率高63%[19]。因此，应将血脂异常纳入PCOS的日常健康治疗方案中。本研究发现，PCOS组大鼠三酰甘油、胆固醇和低密度脂蛋白的含量明显增加，高密度脂蛋白含量明显下降，洋甘菊提取物可使大鼠三酰甘油、胆固醇和低密度脂蛋白的含量明显下降，高密度脂蛋白含量增加。

综上所述，洋甘菊提取物可通过降低体重、子宫指数和胰岛素抵抗指数，调节性激素、瘦素和血脂水平，从而改善PCOS大鼠的生殖功能。因此，洋甘菊提取物用作治疗PCOS的可选药物，可为临床上治疗PCOS提供新的理论依据。