藏药普尔那提取物对宫颈癌海拉细胞增殖作用的研究∗

陈 静，褚福浩，金珠措姆，索朗次仁，单增卓嘎

1 西藏藏医药大学，西藏 拉萨 850000；2 北京中医药大学

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤疾病之一。全世界每年死于宫颈癌的女性超过20 万人。目前，该病的死亡率已攀升至女性癌病的第二位。藏药普尔那Artemisia vestitaWall.ex Bess.为菊科蒿属植物全草，具有清热解毒、杀虫利湿等功效，藏医临床常用来治疗虫病、脑炎、皮肤病、温毒疔毒疮、咽喉病等［1-5］，现代研究也用于治疗妇科疾病，如乳腺炎、慢性附件炎、痛经等［6］。查阅文献可知，藏药普尔那的化学成分有绿原酸［7］、熊果酸［8］、棕矢车菊素、柳穿鱼素、中国蓟醇、伞型花内酯和蓟黄素等，基于熊果酸、棕矢车菊素具有抗肿瘤活性［9-12］，本研究以四唑盐（MTT）比色法检测普尔那不同部位的乙酸乙酯提取物、石油醚提取物对宫颈癌海拉细胞（hela cell）的作用，为其科学、合理用药提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 实验细胞宫颈癌hela 细胞由中国科学院纳米科研中心提供。

1.2 试药RPMI-1640 培养基（HyClone，批号：AF29584257），DMEM培养基（Gibco，批号：8120350），0.25%胰蛋白酶溶液（Gibco，批号：2177715），磷酸盐缓冲液（Corning，批号：05717003）；胎牛血清（FBS，四季青，批号：20030502）；噻唑蓝（MTT，阿拉丁，批号：20170606）；二甲基亚砜（DMSO，天津百伦斯生物技术有限公司，批号：20170720）；青链霉素混合液（Gibco，批号：1640831）。

1.3 实验仪器3111 型CO2培养箱（Thermo）；生物安全柜（HFsafe）；酶标仪（Multiskan GO）；LD5-2B 型台式低速离心机（京立）；IX71 倒置荧光显微镜（Olympus）；96 孔板（Corning）；离心管（Costor）；其他耗材均为国产耗材。

2 实验方法

2.1 普尔那提取物制备分别取干燥的普尔纳根茎、叶的粉末10 g，加入10倍量80%乙醇，50℃、频率100%超声提取3次，每次1 h，滤过，合并提取液，提取液减压浓缩至无醇味。用水复溶，以乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩至浸膏状态，烘干，称质量，得根茎乙酸乙酯提取物（GE）和石油醚提取物（GP）、叶乙酸乙酯提取物（YE）和石油醚提取物（YP）。称取一定量的GE、GP、YE、YP，分别加入适量的DMSO配制成10 mg/mL的储备液，其中DMSO占总体积比小于10%。取0.22 μm 的无菌滤膜，过滤除菌，得滤液，备用。

2.2 细胞培养宫颈癌hela细胞培养在含有1%胎牛血清、1%双抗的DMEM 培养液中，置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，隔天更换培养液。hela 细胞呈贴壁状态生长，待细胞数量适量、生长状态良好（对数生长）时传代培养或铺板。

2.3 倒置显微镜观察hela 细胞形态根据预实验结果确定普尔那不同提取物的浓度梯度为125、250、500 μg/mL。将各提取物分别加入到宫颈癌hela 细胞中，培养48 h，在倒置显微镜下观察细胞形态。

2.4 MTT 法检测hela 细胞的增殖取对数生长期的宫颈癌HeLa 细胞，以3×103个/mL 的细胞数浓度接种于96 孔培养板中，每孔加入100 μL，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养24 h，弃去培养基。取一定量的储备液用新鲜培养液稀释至系列浓度0、125、250、500 μg/mL 的待测样品液，在有细胞的孔板中分别加入100 μL 不同浓度的待测液，并设空白组（无细胞，仅加入培养基），测试组与空白组均设置4 个复孔，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养72 h。每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT 溶液（避光操作），继续培养4 h 后终止培养。弃去上清液，加入150 μL/孔的DMSO，充分震荡，待紫色结晶充分溶解后，用酶标仪测定490 nm下的OD 值，计算不同浓度普尔那乙酸乙酯提取物对肝癌细胞hela 的增殖抑制率，正常组为加入浓度为0 μg/mL的待测液。

2.5 统计学方法采用SPSS 20.0 软件分析数据，计量资料以表示，采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

125 μg/mL浓度GE、YP、GP对hela细胞增殖有一定的抑制作用，但抑制作用不明显；高剂量GP和YE 对hela 细胞表现出一定抑制活性；低剂量GE 和YP 对hela 细胞表现出一定抑制活性，随着浓度的升高，抑制作用降低。见表1。

表1 不同浓度GE、GP、YE、YP对宫颈癌hela细胞增殖的抑制率比较（） %

表1 不同浓度GE、GP、YE、YP对宫颈癌hela细胞增殖的抑制率比较（） %

4 讨论

藏药普尔那具有抗菌、消炎的作用，广泛用于藏医临床［12-14］。体外实验表明，GP、YE部位随浓度增加，其对细胞增殖具有一定的抑制作用，而GE、YP 部位则随着浓度的增加，其对细胞增殖的抑制作用降低［15］。125 μg/mL 的低浓度YP 部位的抑制作用相对最强，抑制率为（65.0±0.30）%。

普尔那提取物对hela 细胞增殖具有一定的抑制作用，其不同部位提取物表现出的抑制规律显著不同，应进一步研究藏药普尔那的物质基础、药理活性，进行体外、动物毒性实验，严格控制其临床使用剂量。