消肿止痛巴布剂的制备工艺研究∗

李智勇，陈玉兴，赵自明，张建军，陈雪婷，卢 泳，3

1 广东省第二中医院/广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095；2 广东省中医药研究开发重点实验室；3 广州中医药大学

消肿止痛巴布剂（Xiaozhong ZhitongCataplasm，XZC）方由《证治准绳》所载“乳香散”加减化裁而来，主要由大黄、黄柏、姜黄、泽兰等药物组成，具有活血化瘀、清热凉血、止痛消肿的功效［1-2］。主要用于治疗跌打损伤，瘀血肿痛等急性软组织损伤。本研究根据处方中药物所含功效成分的化学性质和药理作用，以初步药效学实验结果为指标，优选适宜的提取工艺，并对XZC 的制备工艺参数进行优化研究，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级SD 大鼠80 只，雌雄各半，体质量范围180～220 g，购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2013-0002，质量合格证号：44007200028037。动物实验环境：广东省中医药工程技术研究院SPF 级动物实验室［许可证号SYXK（粤）2015-0059］。

1.2 实验药物中药饮片（广州康圣中药饮片有限公司，批号：20150801），检验结果显示均符合《中华人民共和国药典》2015年版一部各项下的规定。盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110713-201212）；双氯芬酸二乙胺乳膏剂（商品名：扶他林，瑞士诺华有限责任公司，国药准字H19990291，批号：VP0098）；治伤软膏（浙江普洛康天然药物有限公司，国药准字Z20027559，批号：150506）；乙腈（默克）为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.3 实验仪器DC-NSG-30 型多功能提取浓缩机组（上海达程实验设备有限公司）；METTLER XS-205DU 型电子分析天平（瑞士）；DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精密实验设备有限公司）；BT-S-1 型小型试验巴布剂涂布机（温州市皓丰机械有限公司）；BBV-T 型初黏力测试仪；持黏力测试仪（济南格瑞特测试仪器有限公司）；-80℃超低温冰箱；5424 型小型高速离心机（德国Eppendorf公司）；数显游标卡尺。

1.4 实验方法

1.4.1 样品制备 1）XZC样品1：取全方饮片粉碎成细粉，加入基质，混匀，制成每克含有0.19 g生药。2）XZC样品2：取全方饮片加8倍量水，提取3次，每次1 h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.20（60℃），加入基质，混匀，制成每克含有1.05 g生药。3）XZC样品3：取大黄、姜黄粉碎成细粉，备用；其余饮片加8倍量水，提取3次，每次1 h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.20（60℃），加入细粉和基质，混匀，使每克含有0.46 g生药。4）XZC样品4：取四分之一的饮片粉碎成细粉，备用；其余饮片加8倍量水，提取3次，每次1 h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.20（60℃），加入细粉，加入基质，混匀，使每克含有0.64 g生药。

1.4.2 动物处理 所有SD大鼠常规饲养3天后，随机分为正常对照组、模型对照组、扶他林组、治伤软膏组、XZC 样品1 组、XZC 样品2 组、XZC 样品3组、XZC 样品4 组，每组10 只。所有大鼠双侧后肢小腿部剃毛，定位测量各组大鼠右脚脚跖宽度，作为基础值。除正常对照组外，其余各组均进行脚跖局部软组织挫伤造模，造模时用辗压器在脚跖中部连续辗压3 次，造成局部软组织挫伤。除正常对照组、模型对照组外，其余各组大鼠辗压后立即给予对应药物涂抹，涂抹范围以瘀斑面积相同，正常对照组、模型对照组大鼠涂抹等量膏体基质，连续涂抹3天。末次给药2 h后观察病情评分。

1.4.3 观察指标 软组织损伤病情程度评分标准［1-2］。1）触痛：受损组织局部触痛很明显计3分，触痛明显计2 分，触痛不明显计1 分，无触痛计0分。2）肿胀：受损组织局部红肿面积≥0.5 cm2计3分，红肿面积≥0.3 cm2，＜0.5 cm2计2分，红肿面积≥0.1 cm2，＜0.3 cm2计1 分，无红肿计0 分。3）功能障碍：受损伤肢明显跛行，行走困难计3 分，受损伤肢有跛行计2 分，受损伤肢跛行不明显计1分，无跛行计0分。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0 软件进行数据统计分析，计量资料以表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，组间均数两两比较，方差齐时采用SNK 法，方差不齐时采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

与正常对照组比较，模型对照组大鼠右足软组织损伤病情程度评分在辗压后1、2、3天显著增高。与模型对照组比较，给药1天后扶他林组，治伤软膏组，XZC样品1、2、3、4组大鼠右足软组织受损病情程度评分降低（P＜0.05）；连续给药2、3天后，扶他林组，治伤软膏组，XZC样品1、3、4组大鼠右足软组织受损病情程度评分明显降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠软组织损伤病情程度评分比较（）

表1 各组大鼠软组织损伤病情程度评分比较（）

注：与正常对照组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；与模型对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

3 巴布剂配置工艺参数考察

由“2.1”项下结果可知，XZC 样品1 和4 的消肿止痛效果相对较好，结合临床用法和载药量需求，确定样品4 的制备工艺为基本工艺：处方四分之一的饮片粉碎成细粉，过100 目筛，备用；其余饮片加水提取的工艺，进一步对其巴布剂的配置工艺参数进行研究。

3.1 粉碎工艺条件的确立分别称取上述药材饮片各3 份，每份300 g，置粉碎机中粉碎成细粉，取能通过六号筛的粉末，称取质量，计算细粉得率。结果表明，各药材粉碎后得粉率都在93%以上，符合要求，说明药材的粉碎工艺可行。

3.2 水提取工艺研究采用正交试验设计，以干膏得率和黄柏的有效成分之一小檗碱浓度为评价指标，对加水量、提取时间和提取次数等因素进行优选，优化提取工艺并进行试验验证。

3.2.1 样品制备 对照处方比例称取大黄等饮片共9 份，每份310 g，按照表2 的正交试验设计安排进行试验，滤过，合并滤液，浓缩并转移至500 mL，定容，摇匀，分别测定干膏得率和小檗碱含量。

3.2.2 干膏得率的测定 精密吸取各试验的样品溶液20 mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，按《中华人民共和国药典》2015 年版四部通则2201浸出物测定法［3］202测定，计算干膏得率。

3.2.3 小檗碱的含量测定［4］

3.2.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.50 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶60）（每100 mL 加十二烷基硫酸钠0.4 g）；波长：345 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃。

3.2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇使溶解，制成每1 mL含盐酸小檗碱对照品248 μg的对照品储备溶液。

3.2.3.3 标准曲线的绘制 分别精密吸取上述盐酸小檗碱对照品储备溶液0.5，1，2，3，4 mL 置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别制成每毫升含有盐酸小檗碱12.4，24.8，49.6，74.4，99.2 μg 的对照品溶液。分别吸取10 μL 注入液相色谱仪，测定，记录色谱峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得标准曲线的回归方程为Y=41.114X-66.161，相关系数r=0.999 85。表明盐酸小檗碱在浓度范围12.4～99.2 μg/mL线性关系良好。

3.2.3.4 供试品溶液的制备 精密吸取各试验样品溶液1 mL，置50 mL 量瓶中，加甲醇45 mL，摇匀，超声处理30 min（功率250 W，频率40 kHz），取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液2 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.2.3.5 专属性考察 按处方比例称取除黄柏药材外的饮片共260 g，加10倍量水，煎煮2次，每次1 h，常压浓缩至500 mL，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。吸取上述供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各10 μL 注入液相色谱仪，照上述色谱条件测试，结果供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上有相同色谱峰，阴性对照溶液色谱在相应位置无吸收，说明阴性无干扰，该法专属性良好。

3.2.3.6 测定法 吸取上述对照品溶液、供试品溶液各10 μL，照上述色谱条件测定，计算小檗碱浓度，结果见表2。

3.2.4 正交试验优选 采取L9（34）正交试验设计，选取加水倍数、提取时间、提取次数作为考察因素，各取3 个水平进行试验。其中小檗碱是为君药黄柏有效成分之一，含量测定方法成熟，拟定小檗碱权重系数0.6，干膏得率权重系数0.4，以二者的综合评分［5-6］作为评价指标，并利用SPSS 17.0 统计软件进行数理统计，筛选提取工艺参数。由直观分析可知，影响提取效果的因素顺序为：提取次数（A）＞加水倍量（B）＞提取时间（C），由此得出的最佳工艺组合为A3B3C3。由综合评分结果可知，得分最高工艺组合为A3B3C2。方差分析结果显示提取次数（A）对水提工艺具有显著性影响，而加水倍量（B）和提取时间（C）无显著影响。综合考虑到降低生产成本，缩短生产周期等综合因素，选择A3B1C1为优选工艺，即提取3 次，每次加水量为6 倍，提取时间为1 h。正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 水提正交试验结果

表3 方差分析结果

3.2.5 验证试验 按处方比例称取药材3 份，每份620 g，照优化工艺参数进行验证试验，滤过，合并滤液，浓缩，定容至1000 mL。分别测定干膏得率和小檗碱浓度，计算综合评分。由表4 可知，验证试验结果与正交试验优选结果基本吻合，说明拟定提取工艺条件基本合理、稳定。见表4。

表4 验证试验结果

3.3 浓缩工艺的考察以盐酸小檗碱保留率为考核指标，对比常压浓缩和减压浓缩工艺。称取提取液（盐酸小檗碱含量为0.3744 mg/g）2 份，每份36.40 kg，分别采用常压浓缩和减压浓缩（浓缩条件：80℃，真空度-0.06 MPa）进行浓缩，浓缩至约750 g，称定质量，分别测定相对密度（60℃）和盐酸小檗碱的含量，计算盐酸小檗碱保留率。结果显示，减压浓缩工艺的盐酸小檗碱保留率略高于常压浓缩工艺，因此选择减压浓缩（80℃，-0.06 MPa）。见表5。

表5 浓缩工艺考察结果

3.4 XZC的制备工艺研究

3.4.1 XZC 的制备 将处方量四分之一的大黄、黄柏、泽兰等饮片粉碎成最细粉；其余饮片煎煮3次，每次1 h，滤过，合并，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.30（60℃），加入药材细粉，混匀。再与由甘油、聚丙烯酸钠、甘羟铝、高岭土、酒石酸、纯化水等组成的基质混匀，涂布，切片，晾干，即得。

3.4.2 质量评价指标及检测方法

3.4.2.1 初黏力 按照《中华人民共和国药典》2015 年版四部通则0952 黏附力测定法第一法测定［3］130，每个样品平行测定5 次，以测得最大值为100 分，并按照（测得值/最大值）×100 计算初黏力得分。

3.4.2.2 持黏力试验 按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0952黏附力测定法第二法测定［3］131，以50 g 的砝码试验，记录试验开始至滑脱的时间，每个样品平行测定5 次，以测得最大值为100 分，并按照（测得值/最大值）×100 计算持黏力得分。

3.4.2.3 外观评价评分标准 按照文献［7］方法分别对基质均匀性、表面光泽度、气泡状态等进行评价，并对各项的综合得分按权重求和，以最大值为100 分，并按照（测得值/最大值）×100 计算外观评价得分。

3.4.3 基质载药量的优选

3.4.3.1 均匀试验设计 因素水平选择根据文献以及巴布剂基质制备方法［8-13］，固定药粉为25 g，药物浓缩液30 g（每克相当于2.5 g 饮片），以外观、初黏力、持黏力等为评价指标，对甘油（37～100 g）、高岭土（0.17～5 g）、酒石酸（0～0.42 g）、甘羟铝（0.18～0.60 g）、吐温80（0.16～1.00 g）、聚丙烯酸钠（1.7～8.00 g）6种基质配方进行均匀设计试验，优选最佳配比。

3.4.3.2 均匀设计试验与结果 根据拟定的因素水平方案，按照U22（226）均匀设计表［14］安排，制成巴布剂，晾干，照拟定评价指标与检测方法试验。见表6。

表6 均匀设计试验与结果

3.4.3.3 均匀试验结果与数理统计［15］以综合评分为因变量，各因素为变量，利用DPS 15.10 数据处理软件进行二次多项式逐步回归分析，得回归方程：Y=196.6605-124.2771X3-84.6405X4-16.3695X6+0.39082X12+0.0064X22+350.8948X32-35.7531X52+1.9180X62-3.0728X1×X5-0.12767X2×X6+80.6682X4×X5+18.8113X4×X6+1.4985X5×X6。通过对方程的F检验结果显示，各系数P值均小于0.05，表明该方程的各个系数均具有显著性意义。根据该方程计算确定的最优配方为高岭土∶甘油∶酒石酸∶甘羟铝∶吐温80∶聚丙烯酸钠质量比1.20∶50∶0.10∶0.6∶0.15∶8.4。

3.4.3.4 验证试验 按照优选的基质配方制备3 批消肿止痛巴布剂，测定其初黏力、持黏力及综合感官指标，计算综合评分值。结果表明，按均匀设计试验优选结果制备的XZC 色泽均一，延展性良好，外观平整光滑，且能满足黏性要求，综合评分值与均匀试验结果基本相符。见表7。

表7 验证试验结果（n=5）

3.5 中试放大研究根据拟定工艺进行三批中试放大研究，每批投料饮片19.84 kg，结果成品得率分别为94.3%、93.1%、94.6%，中试产品检验结果显示各工艺参数稳定，说明优选的工艺基本合理，产品质量稳定。

4 结论

在中药巴布剂（凝胶贴膏）的制备过程中，饮片的粉碎、提取对其制备工艺、药效具有一定的影响，本研究结合当前临床的使用情况，设计采用不同提取工艺样品对大鼠急性软组织损伤作用的影响，优选了XZC 的提取工艺路线，并进一步采用单因素和正交实验设计法相结合的方法对中间品的生产工艺进行优化，明确了XZC 的粉碎、提取、浓缩工艺的参数。提取工艺路线筛选过程中，在选用消痛止痛巴布剂对急性软组织损伤大鼠病情程度评估评分的同时，还选用了对急性软组织损伤大鼠脚肿胀的影响以及对急性软组织损伤大鼠脚跖软组织白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）的影响作为评价指标，统计分析结果与其基本相同，因此只列了对急性软组织损伤大鼠病情程度评估评分作为评价指标。

巴布剂的基质配方是影响巴布剂制剂成型和保障临床疗效的关键因素，根据药物的性质和加入形态，以及基质配方组分的理化性质，选择合适的基质组分和比例是巴布剂制备的技术难点和关键［16］。因此在XZC 的制剂成型过程中，采用巴布剂质量控制的初黏力、持黏力以及外观性状等关键指标作为评价依据，采用均匀试验设计方法进行多组分多水平的基质配方优选，通过对各次试验结果及基质配方组成进行二次多项式逐步回归分析，采用方程拟合法预测最优的消痛止痛巴布剂基质组成配方，进一步通过验证试验确立成型工艺的参数。中试放大研究结果显示，本研究确定的XZC 制备工艺基本合理，稳定，产品质量稳定，可以适应该制剂的生产，为其质量标准的建立和制剂稳定性的考察奠定了基础。