基于ERK/MAPK 信号通路探讨青藤碱对SW480 结肠癌细胞活性抑制作用的研究∗

吴大春，谌雁冰

上海市松江区中心医院，上海 201600

结肠癌（colon cancer，CC）是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处［1］。流行病学资料显示，全球每年约有120万新发结直肠癌患者，发病率男性为16.6/10万，女性为14.7/10万，而我国结直肠癌发病率占全世界的18.6%左右［2］，并且随着生活水平的提高、饮食结构的改变等表现出逐年增加和年轻化的趋势［3］，受到医学界的重视。结肠癌一般呈息肉状、溃疡型等，可沿肠管蔓延、深层浸润、腹腔种植等，出现扩散转移。结肠癌漏诊率较高，确诊时多属于中晚期，除外科手术外，化学药物是治疗结肠癌的重要手段。目前。5-氟尿嘧啶占据结肠癌化疗的主导地位，也常与其他药物联合使用以提高治疗效果，但疗效并不理想，因此，寻找更为安全有效的药物对于结肠癌的治疗尤为重要。青藤碱是从中药青风藤中提取的生物碱成分，药理活性广泛。陈伟毅等［4］研究认为，其能抑制多种恶性肿瘤细胞的生长，但关于其对于结肠癌影响的研究较少。故本研究，主要探讨青藤碱对SW480结肠癌细胞活性抑制作用及对细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验细胞SW480 人结肠癌细胞株，品牌：ATCC，细胞活力：90%（上海素尔生物科技有限公司）。

1.2 试药与试剂青藤碱（上海宝曼生物科技有限公司，纯度：HPLC≥98%，CAS 号：115-53-7，货号：D0116，规格：20 mg/支），使用时用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，细胞培养液稀释成浓度为2、4、8、16、20 mmol/L的青藤碱溶液；RPMI-1640基础培养液、RPMI-1640 完全培养液（含10%胎牛血清+青霉素100 U/mL+链霉素100 μg/mL）（常州贝源鑫生物科技有限公司，批号：20190313、20190221）；PBS、磷酸盐吐温缓冲液（PBST）、TBST 缓冲液、0.25%胰蛋白酶溶液（上海联迈生物工程有限公司，批号：20190405、20190311、20190325、20190209）；细胞增殖及毒性检测（CCK-8）试剂盒（天津泰泽兴业生物科技有限公司，批号：20190116）；藻红蛋白标记的磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V-PE）法细胞凋亡检测试剂盒（南京科佰生物科技有限公司，批号：20190530）；RIPA 裂解液（含苯甲基磺酰氟）（北京君诺德生物技术有限公司，批号：20190422）；二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（上海经科化学科技有限公司，批号：20190302）；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒（长沙达尔锋生物科技有限公司，批号：20190322）；超敏电化学发光检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：20190508）；鼠抗人B 淋巴细胞瘤2（B lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteine-containing aspartic acid proteolytic enzymes-3，Caspase-3）、细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）单克隆抗体、鼠抗人肌动蛋白（anti-beta-actin，βactin）多克隆抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（厦门慧嘉生物科技有限公司，批号：20190117、20190209、20190106、20190426、20190218、20190310、20190413）。

1.3 实验仪器Thermo Forma 3110 型二氧化碳（CO2）细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；ROTOFIX32A 型离心机（德国Hettich 公司）；SuPerMax 3000AL 型酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）；Guava EasyCyte 型流式细胞仪（美国MILLPORE 公司）；Powerpac Universal 型电泳仪（美国Bio-rad 公司）；MG6000 型凝胶成像分析仪（北京托摩根生物科技有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养及传代［5］取出37℃保存的SW480 细胞，置于含有RPMI-1640 完全培养液的无菌培养瓶内，混匀制成细胞悬液，采用CO2细胞培养箱（37℃、5%CO2）进行细胞培养，待细胞贴壁生长融合＞90%时（对数生长期），倒掉培养液，采用0.25%胰蛋白酶消化液1 mL 处理细胞，3 min 后加入RPMI-1640 完全培养液5 mL 终止消化，吹打制成单细胞悬液，离心半径：10.5 cm，1500 r/min，离心5 min，细胞沉淀中加入RPMI-1640 完全培养液重悬细胞，之后接种于新的培养瓶进行传代，继续培养。

1.4.2 CCK-8 法检测青藤碱对SW480 细胞增殖的抑制作用［5］取贴壁生长至对数生长期的SW480细胞，倒掉培养液，采用0.25%胰蛋白酶消化液1 mL 处理细胞，3 min 后加入RPMI-1640 完全培养液5 mL 终止消化，吹打制成单细胞悬液，采用RPMI-1640 完全培养液将细胞悬液浓度调整为2×105个/mL。取96 孔板，每孔接种SW480 细胞悬液100 μL，采用CO2细胞培养箱（37℃、5%CO2）进行细胞培养。待细胞贴壁后，弃掉孔内上清液，分别加入2、4、8、16、20 mmol/L 的青藤碱溶液100 μL，每个浓度设6个平行复孔。设对照组（加入0 mmol/L青藤碱溶液100 μL）和空白组（无细胞，仅RPMI-1640 完全培养液100 μL）；采用CO2细胞培养箱（37℃、5%CO2）继续培养细胞，分别于培养24、48、72 h 后，按照试剂盒说明，除去含药培养液，每孔加入CCK-8 工作液10 μL，继续培养4 h；采用Su-PerMax 3000AL 型酶标仪，在450 nm～600 nm 波长处，检测各孔吸光度A值。之后计算各组SW480细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率（%）=（对照组吸光度A 值平均值-实验组吸光度A值平均值）/对照组吸光度A值平均值×100%

1.4.3 流式细胞术检测各组SW480 细胞凋亡情况［6］取贴壁生长至对数生长期的SW480细胞，倒掉培养液，采用0.25%胰蛋白酶消化液1 mL 处理细胞，3 min 后加入RPMI-1640 完全培养液5 mL 终止消化，吹打制成单细胞悬液，采用RPMI-1640 完全培养液将细胞悬液浓度调整为1.5×106个/mL；取6 孔板，每孔接种SW480 细胞悬液200 μL，采用CO2细胞培养箱（37℃、5%CO2）进行细胞培养；24 h后，分别加入0（对照组）、4、8、16 mmol/L的青藤碱溶液100 μL，每组设6 个复孔，继续培养24 h 后，滴加0.25%胰蛋白酶消化液1 mL 消化细胞3 min，以离心半径10.5 cm，1500 r/min，离心5 min，弃上清，细胞沉淀用预冷的PBS 洗涤2 次后重悬；取细胞悬液100 μL，按照试剂盒说明书进行操作，加入Annexin V-PE 细胞凋亡检测试剂100 μL，于避光处培养20 min；上机，采用Guava EasyCyte 型流式细胞仪检测各组SW480细胞凋亡率。

1.4.4 蛋白质免疫印迹（Western Blot）法检测各组SW480 细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表达水平［7］按照“1.2.3”项中的方法培养SW480 细胞，并分组采用相应药物处理，采用CO2细胞培养箱（37℃、5%CO2）培养24 h 后取出，以离心半径10.5 cm，1500 r/min，离心5 min，弃上清，细胞沉淀用PBS 洗涤3 次；加入RIPA 裂解液（含苯甲基磺酰氟）300 μL，4℃裂解30 min 后，以离心半径8.5 cm，13 000 r/min，离心10 min，上清液中即含有抽提的细胞总蛋白；按照BCA 试剂盒说明书操作进行蛋白定量；加入上样缓冲液（5×）75 μL，沸水浴5 min 使蛋白变性；配制SDSPAGE 凝胶灌注于电泳仪上，上样，采用电泳仪分离目的蛋白至溴酚兰跑出分离胶；将目的蛋白转膜至硝酸纤维素膜上，用丽春红S 溶液复染，PBST洗涤硝酸纤维素膜至脱色；TBST 缓冲液（含5%脱脂奶粉）室温封闭硝酸纤维素膜1 h，之后TBST 缓冲液洗涤；将硝酸纤维素膜分别放入1：1000 稀释的Bcl-2、Bax、Caspase-3、ERK1/2、p-ERK1/2 及内参β-actin 一抗，4℃孵育过夜；取出硝酸纤维素膜，采用TBST 缓冲液洗膜10 min×3 次，之后置于1∶12 000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG溶液内，室温孵育1 h，之后TBST 洗涤10 min×3 次；在暗室内，用超敏电化学发光检测试剂盒处理硝酸纤维素膜，X 光片曝光、显影、定影，自来水冲洗、晾干。MG6000 型凝胶成像分析仪对目的蛋白条带进行拍照，Quantity one 软件分析各蛋白条带灰度值，计算各组细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白灰度值与β-actin 灰度值的比值，获得各目的蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0 软件进行数据统计分析，计量资料采用表示，多组间资料比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SW480 细胞增殖抑制率药物处理24、48、72 h 后，与对照组比较，青藤碱4、8、16、20 mmol/L组SW480细胞增殖抑制率升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且同一时间青藤碱4 mmol/L组＜8 mmol/L组＜16 mmol/L 组及20 mmol/L 组；一定范围内，青藤碱浓度相同时，处理时间越长，SW480 细胞增殖抑制率越高，表现为剂量、时间依赖性。而青藤碱2 mmol/L 组SW480 细胞增殖抑制率与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；青藤碱20 mmol/L组SW480细胞增殖抑制率与青藤碱16 mmol/L组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。根据检测结果，选用4、8、16 mmol/L 浓度青藤碱进行后续实验。见表1。

表1 各组SW480细胞增殖抑制率比较（） %

表1 各组SW480细胞增殖抑制率比较（） %

注：*表示与对照组比较，P＜0.05；▲表示与青藤碱2 mmol/L组比较，P＜0.05；#表示与青藤碱4 mmol/L组比较，P＜0.05；△表示与青藤碱8 mmol/L组比较，P＜0.05

2.2 SW480 细胞凋亡率流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，青藤碱4、8、16 mmol/L 组SW480 细胞凋亡率较高，且青藤碱4 mmol/L 组＜8 mmol/L 组＜16 mmol/L 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组SW480细胞凋亡率比较（） %

表2 各组SW480细胞凋亡率比较（） %

注：*表示与对照组比较，P＜0.05；#表示与青藤碱4 mmol/L组比较，P＜0.05；△表示与青藤碱8 mmol/L组比较，P＜0.05

2.3 SW480 细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达水平与对照组比较，青藤碱4、8、16 mmol/L组BcL-2 蛋白表达水平较低，且4 mmol/L 组＞8 mmol/L组＞16 mmol/L 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，青藤碱4、8、16 mmol/L 组Bax、Caspase-3 蛋白表达水平较高，且4 mmol/L 组＜8 mmol/L 组＜16 mmol/L 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3，图1。

图1 Western Blot法检测SW480细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平

表3 各组SW480细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平比较（）

表3 各组SW480细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平比较（）

注：*表示与对照组比较，P＜0.05；#表示与青藤碱4 mmol/L组比较，P＜0.05；△表示与青藤碱8 mmol/L组比较，P＜0.05

2.4 SW480 细胞ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表达水平与对照组比较，青藤碱4、8、16 mmol/L 组p-ERK1/2 蛋白表达水平较低，且青藤碱4 mmol/L组＞8 mmol/L 组＞16 mmol/L 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组与青藤碱4、8、16 mmol/L 组ERK1/2 蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4，图2。

图2 Western Blot法检测SW480细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平

表4 各组SW480细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平比较（）

表4 各组SW480细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平比较（）

注：*表示与对照组比较，P＜0.05；#表示与青藤碱4 mmol/L组比较，P＜0.05；△表示与青藤碱8 mmol/L 组比较，P＜0.05

3 讨论

结肠癌起源于肠黏膜，其发生主要受到高脂肪及低纤维素饮食的影响，还与家族肿瘤遗传史、吸烟、饮酒、体力活动不足、红肉摄入过多、肥胖等危险因素有关［8］。结肠癌发病率居于胃肠道肿瘤的第三位，其起病隐匿，确诊时部分病例已失去手术根治时机，只能以全身化疗为主要治疗手段，但大多数化疗药物的毒副反应明显，疗效也十分有限。近年来许多学者集中探索了在体外环境下中药提取物对结肠癌细胞系的生长抑制、细胞周期调控作用［9］，为新型植物化疗药物的研发提供了思路，也指出了目前研究的方向。青藤碱是提取自中药青风藤的活性成分，化学结构与吗啡类似。秦峰等［10］药理研究显示，青藤碱能够调节免疫功能、抑制炎症反应，具有抗肿瘤、减轻脏器缺血再灌注损伤、镇痛镇静、降血压等作用，在类风湿性关节炎、心律失常、肾小球肾炎等疾病的治疗中均有较好的应用。关于其抗肿瘤作用，姜宇懋等［11］研究认为，青藤碱能够通过阻滞细胞G1期，抑制细胞增殖，加速细胞凋亡，降低侵袭转移能力，抑制肿瘤血管生成，调节肿瘤微炎症环境，逆转肿瘤细胞多药耐药性等控制肿瘤进展，对于胃癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤生长抑制作用明显。杨海波等［12］的体外研究发现，青藤碱能通过阻滞细胞周期进程来抑制人结肠癌SW480 细胞增殖，但具体的作用机制尚未完全明确。

此次研究主要探讨青藤碱对SW480 结肠癌细胞活性的抑制作用及对于ERK/MAPK 信号通路的影响。分别采用青藤碱2、4、8、16、20 mmol/L不同浓度的青藤碱处理SW480 细胞24、48、72 h，之后用CCK-8法检测细胞增殖情况，CCK-8法是目前最具潜力和优势的细胞活性毒性检测方法［13］，较MTT 法有操作简便、检测周期短等优势。结果发现，青藤碱4、8、16、20 mmol/L 青藤碱能够不同程度的抑制SW480 细胞增殖，而且有剂量-时间依赖表现（P＜0.05），表明青藤碱能够有效降低SW480结肠癌细胞增殖活性，而且药物浓度越高、作用时间越长，效果越明显。

细胞凋亡异常可以导致细胞无限增殖，是恶性肿瘤发生发展的病理基础，同时也是抗肿瘤治疗中中药的作用靶点，可促进肿瘤细胞凋亡，在控制恶性肿瘤进展方面有十分重要的意义。本次研究中，我们采用流式细胞术检测了不同浓度青藤碱对SW480 细胞凋亡情况的影响，结果发现，与对照组比较，青藤碱4、8、16 mmol/L 组SW480 细胞凋亡率较高，且青藤碱浓度越高，SW480 细胞凋亡率也越高，提示青藤碱能有效加速SW480 细胞凋亡，降低肿瘤细胞活性。

MAPK 信号转导通路可以将细胞外信号传导入细胞内，主要包括ERK1/2、c-jun 氨基末端激酶通路、p38 丝裂原活化蛋白激酶通路、ERK5 通路四条信号传导途径，其中以ERK1/2 最为保守。ERK1/2 被激活成为p-ERK1/2 后，一方面能够促进胞质中细胞骨架纤维化，另一方面进入细胞核磷酸化转录因子以调节细胞生长、分化等，另外还能在胞质转红停留并激活其他蛋白激酶，从而参与细胞增殖、分化、凋亡等过程。殷亮等［14］研究认为，ERK/MAPK 信号通路在结肠癌细胞内呈过度激活状态，抑制其活性有助于诱导细胞凋亡。Bcl-2、Bax、Caspase-3 凋亡相关蛋白，其中BcL-2 具有抑制细胞凋亡的作用，Bax 为凋亡抑制因子，Caspase-3 则是细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶，属于凋亡效应因子［15］。Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达均受到ERK/MAPK信号通路的调控，p-ERK1/2 进入细胞核内可上调Bcl-2 表达、下调Bax、Caspase-3 表达，从而促进细胞增殖，抑制细胞凋亡［16］。本研究结果显示，与对照组比较，青藤碱4、8、16 mmol/L 组SW480 细胞Bcl-2、p-ERK1/2 蛋白表达水平降低，Bax、Caspase-3 蛋白表达水平升高，而ERK1/2 蛋白表达水平无明显变化，而且青藤碱16 mmol/L组变化最明显，表明青藤碱可能通过抑制ERK1/2磷酸化，降低ERK/MAPK信号通路活性，抑制下游Bcl-2蛋白表达，促进Bax、Caspase-3 蛋白表达，来发挥促进SW480 细胞凋亡的作用，作用效果与药物浓度有关。

综上所述，青藤碱能剂量依赖性抑制SW480结肠癌细胞增殖活性，促进细胞凋亡，其作用可能与抑制ERK/MAPK 信号通路活性，调节Bcl-2、Bax、Caspase-3等相关凋亡蛋白表达有关。