一例猪流行性腹泻病毒变异株引起仔猪腹泻的诊断

华 珍 武夷山市农业农村局 福建武夷山 354300

近来年，国内猪场对猪病的防控意识逐渐提高，但仔猪腹泻仍是威胁我国生猪养殖发展的主要疾病之一，且每年因仔猪腹泻死亡所造成的经济损失巨大。在生猪饲养中，引起仔猪腹泻的病毒性病原种类繁多，包括猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德塔冠状病毒（PDcoV）和猪轮状病毒（PRoV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）和猪细小病毒（PPV）等，以上病原感染仔猪所导致的临床症状及病理变化较为相似，使用传统临床诊断方法无法确诊，继而延误疾病防治[1]。随着分子生物学技术的快速发展，以PCR/RT-PCR技术为核心的检测方法广泛应用于猪场病原的快速诊断，这为疾病的防控提供了便捷的技术手段。

2020年11月初，福建省南平地区某养殖场仔猪暴发腹泻，笔者根据发病仔猪临床症状特点，采集其小肠组织样品进行实验室检查，结果该场暴发的腹泻是由PEDV变异株引起，现将具体诊断过程报道如下。

1 材料与方法

1.1 病例情况 福建南平某猪场饲养繁殖母猪40余头，该场于2020年11月初，部分栏舍仔猪开始腹泻，其后猪场饲养员给腹泻仔猪灌服抗生素，但效果不佳。至11月7日，该场已有80余头仔猪发病，死亡42头。据养殖户介绍，发病猪群典型临床症状即为急性腹泻，且部分仔猪呕吐，导致患猪死亡的大部分原因是严重脱水。为确诊，采集发病严重的仔猪小肠、腹股沟淋巴结送至生猪疫病检测中心进行病原诊断。

1.2 主要材料 DNA/RNA核酸提取试剂盒购自北京生化科技有限公司；cDNA反转录试剂盒购自伯乐生命医学产品有限公司；Taq PCR Mix预混液、DL 2000 marker和琼脂糖粉末等均购自于上海生物工程科技公司。

1.3 方法

1.3.1 病料处理与核酸提取 用灭菌刀将小肠和淋巴结组织切碎后，取0.2 g组织与1 mL生理盐水混合，高速匀浆后离心，取200 uL上清根据DNA/RNA提取试剂盒说明书提取样本核酸，将核酸中RNA反转录为cDNA，将cDNA样品保存于-80℃待检。

1.3.2 病原检测 应用商业化病原检测试剂盒采用实时荧光定量PCR法分别检测样品中是否含有PEDV、TGEV、PRoV、PDcoV、PRV、PPV和PCV2，根据样品CT值判定其是否为对应病原阴、阳性。

1.3.3 PEDV S1基因序列扩增及分析 用一对特异性引物扩增PEDV S1基因序列，其中RT-PCR体系（50 uL）中包含2×PCR mix预混液25 uL、上下游引物（10 pmoL/L）各2 uL、模板cDNA 3 uL及双蒸水18 uL，反应条件为94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃2 min，共35个循环，72℃10 min，其后将PCR产物进行凝胶电泳，并切胶回收后送至生物公司进行双向测序。将返回序列进行拼接后，在NCBI网站上进行BLAST，比较该序列与GenBank上收录的不同PEDV毒株对应序列的同源性，确定获得毒株所属的基因型。

2 结 果

2.1 病原检测结果 使用商业化试剂盒分别检测可能导致仔猪腹泻的病毒性病原，结果仅从发病猪组织样品中检测出PEDV核酸。此外，我们对样品处理后接种在普通琼脂培养基培养，未发现任何菌落生长，提示该场仔猪腹泻是由PEDV感染引起。

2.2 PEDV S1基因扩增凝胶电泳结果 使用一对特异性引物应用PCR法扩增PEDV S1基因序列，将PCR产物进行凝胶电泳，结果见图1，扩增序列大小约为1900 bp左右，与预期大小基本一致，且无非特异性条带，提示扩增的PCR产物为PEDV S1基因序列。

图1 PEDV S1基因序列扩增PCR产物凝胶电泳图

2.3 PEDV S1基因序列变异情况分析 将PCR阳性产物进行纯化后送至生物公司进行双向测序，对返回序列进行拼接，最终序列大小为1983 bp。核苷酸序列同源性分析结果（见图2）发现，该毒株S1基因序列与GenBank收录的PEDV中国流行变异株（KY624222.1和KY624212.1）同源性较高，均超过97.4%，但与PEDV疫苗株（JN599150.1）同源性相对较低，仅为92.2%。根据以上结果可判定该场此次暴发的腹泻是由PEDV变异株引起。

图2 PEDV分离株S1基因核苷酸序列同源性分析结果

3 讨论

1）近年来，很多养殖场极大程度地提高了生物安全防控水平，这对疫病防控起到了积极作用。但仔猪腹泻在猪场仍然较为常见，且导致仔猪腹泻的病原较多，使用传统的临床诊断方法无法对此类病原进行准确诊断，需依靠更加方便快捷的分子生物学方法。

2）PEDV在我国是导致仔猪腹泻的主要病原之一，该病原为RNA病毒，属冠状病毒科，其基因组变异速率较快，给相应的防控带来巨大考验。在2010年后我国出现了PEDV变异株，与传统毒株相比，变异株毒力更强，对我国养猪业危害也更大。在PEDV基因组中，S1基因变异速率相对较快，选择以S1基因序列进行遗传进化分析可初步明确毒株基因型和变异情况[2-3]。

3）该文涉及到的案例为仔猪严重腹泻，但传统的临床诊断无法对病原进行确诊，笔者采用分子生物学方法，最终确定为PEDV感染。由于PEDV分为疫苗株和变异株，这两种毒株均可导致仔猪腹泻，但基于疫苗株研发的疫苗对变异株的防控能力有限，故笔者通过扩增与分析该毒株的S1基因变异情况，确定该毒株属于变异株。对于猪流行性腹泻的防控，养殖场可以按生物防控和疫苗接种模式进行，其中生物防控包括定期消毒、减少饲养人员在猪舍间流动，同时提高饲养管理水平等；而疫苗接种主要是对猪群免疫接种PEDV相应的弱毒苗或灭活疫苗。