俞氏灌肠方对溃疡性结肠炎模型大鼠肠黏膜β-arrestin1/2、δ阿片受体、Bcl-2及NF-κB表达的影响*

姚嘉明 刘彬彬 叶 蔚 杨一天 王晶磊 王小奇

1 杭州市中医院 浙江 杭州 310007

2 浙江省荣军医院 浙江 嘉兴 314000

溃疡性结肠炎（UC）主要病理改变为累及结直肠黏膜的慢性非特异性炎症。现代医学仍缺乏特效治愈方法。第二批全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师俞尚德先生从医70余年来专攻消化系统疾病，其创制的俞氏灌肠方用于临床治疗该病颇有良效。本研究团队在前期实验研究中，已证实该方对TNBS诱导的UC大鼠具有明确的治疗作用[1]。此次研究乃进一步通过免疫实验检测各组大鼠结肠黏膜β-arrestin1/2、δ阿片受体（DOR）、Bcl-2、NF-κB蛋白表达水平，探索其可能的疗效机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：60只清洁级SD大鼠，雄性，体质量介于160～190g，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心，均由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（沪）2013-0016。饲养场所通风良好，温度维持于18～22℃，湿度维持于45%～65%。

1.2 药物的配制：按处方（黄芩、丹参、蒲公英、红藤、败酱草、半边莲、半枝莲、薏苡仁）以3∶3∶3∶3∶3∶2∶2∶2比例取定量药材（杭州市中医院中药房提供），根据成人等效剂量折算后，以20g·kg-1•d-1为低剂量组，40g·kg-1•d-1为中剂量组，80g·kg-1•d-1为高剂量组，每剂制备浓煎液2ml。美沙拉嗪（法国爱的发制药公司提供）研细加入蒸馏水中摇匀，制成0.3g/kg混悬液。

1.3 模型建立及分组处理：60只大鼠随机分为6组，正常组、模型组、复方低、中、高剂量组及美沙拉嗪组，每组10只。所有大鼠适应性喂养1周后禁食不禁水24小时，腹腔注射麻醉，将直径2mm、长约12cm的硅胶软管从大鼠肛门插入约8cm，除正常组外，将30mg三硝基苯磺酸（TNBS）(0.6ml，由美国SIGMA公司提供)的50%乙醇(0.25ml)溶液0.85ml快速注入，正常组以同体积蒸馏水代替注入。注入后立即捏紧肛门，提起鼠尾倒置约5min，待其麻醉清醒后正常喂养。造模后次日起各组开始药物灌肠，1次/日，共10天。其中正常组、模型组每日灌注蒸馏水2ml；复方各剂量组分别灌注不同剂量复方中药药汁2ml；美沙拉嗪组灌注美沙拉嗪混悬液2ml。实验过程中，复方3组各有1只大鼠因灌肠时操作不当出现肠穿孔死亡，模型组及复方3组共5只大鼠在开始给药治疗后1周内因疾病并发肠梗阻死亡。各组大鼠在实验结束后全部处死，迅速剖取结肠，自肛门以上2cm处向上取结肠6～8cm，沿肠系膜纵轴剪开肠腔，用生理盐水冲洗干净，剪取病变最明显的结肠标本（2cm左右），用4%多聚甲醛固定，逐级酒精脱水，常规石蜡包埋待用。

1.4 检测指标：结肠组织δ阿片受体（DOR）、β-arrestin1、β-arrestin2、Bcl-2、NF-κB蛋白表达，采用免疫组织化学二步法检测。免疫组化结果评定：在显微镜下观察免疫组化结果，黄色或棕黄色染色即阳性表达，蓝色染色即阴性表达。用图像分析软件Image-Pro-Plus6.0进行图像分析，测定积分光密度(IOD)和目标区域面积（area），计算得出平均光密度值（meandensity）作为免疫组化结果，计算公式为Density(mean)=IOD/area。

1.5 统计学分析：采用SPSS 19.0软件包进行统计，所有数据以均数±标准差(±s)表示。

2 结果

各组大鼠结肠组织DOR、β-arrestin1、β-arrestin2、Bcl-2、NF-κB蛋白表达情况，详见表1。模型组大鼠结肠组织中DOR、β-arrestin1、Bcl-2、NF-κB蛋白表达较正常组明显升高，β-arrestin2蛋白表达则明显下降（P＜0.01）；复方低、中、高剂量组及美沙拉嗪组DOR、β-arrestin1、Bcl-2、NF-κB蛋白表达较模型组明显下降（P＜0.01），复方中、高剂量组及美沙拉嗪组β-arrestin2蛋白表达则较模型组明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 各组大鼠结肠DOR、β-arrestin1、β-arrestin2、Bcl-2及NF-κB蛋白的表达（±s，平均光密度值）

表1 各组大鼠结肠DOR、β-arrestin1、β-arrestin2、Bcl-2及NF-κB蛋白的表达（±s，平均光密度值）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

分组正常组模型组复方低剂量组复方中剂量组复方高剂量组美沙拉嗪组例数10 9 7 8 8 1 0 DOR 0.0292±0.0005 0.0809±0.0004ΔΔ 0.0682±0.0005**ΔΔ 0.0489±0.0005**ΔΔ 0.0318±0.0002**ΔΔ 0.0315±0.0002**ΔΔ β-arrestin1 0.0550±0.0031 0.1367±0.0069ΔΔ 0.1115±0.0006**ΔΔ 0.0804±0.0007**ΔΔ 0.0661±0.0015**Δ 0.0740±0.0026**ΔΔ β-arrestin2 0.0792±0.0306 0.0209±0.0076ΔΔ 0.0342±0.0102Δ 0.0424±0.0130*0.0768±0.0178**0.0501±0.0173**Bcl-2 0.0381±0.0019 0.0890±0.0022ΔΔ 0.0624±0.0008**ΔΔ 0.0515±0.0015**ΔΔ 0.0411±0.0007**0.0422±0.0014**NF-κB 0.0079±0.0040 0.0537±0.0150ΔΔ 0.0130±0.0021**0.0128±0.0032**0.0062±0.0029**0.0082±0.0036**

3 讨论

中医药治疗UC具有独特的优势，但多缺乏疗效及机制验证研究。俞老认为UC的病机以湿热蕴肠、气滞络瘀为标，脾虚失健为本，活动期以标实为主，据此创制的俞氏灌肠方在治疗中常能取得良效。该方具清热解毒、活血化瘀、健脾化湿、消肿生肌之功。笔者前期研究已证实该方对UC模型大鼠具有明确的治疗作用[1]。

G蛋白偶联受体(GPCR)是至今所发现的最大的细胞表面受体家族，负责把细胞外信号传递至细胞内。βarrestin是GPCR相关信号通路中重要的信号转导衔接蛋白，可调节GPCR受体的功能。其有β-arrestin1/2两个亚型，在细胞凋亡和活化等过程中起重要的调节作用[2]。目前研究发现，UC发生时T细胞活化的CD28共刺激信号诱导T细胞表达δ阿片受体（DOR），后者诱导CD4+T细胞浆内的β-arrestin1转移至细胞核内并促进Bc1-2基因转录和Bc1-2蛋白表达，从而抑制CD4+T细胞凋亡而使其过度增强致黏膜免疫稳态丧失[3]。本研究结果显示：模型组大鼠结肠黏膜组织DOR、β-arrestin1、Bcl-2表达较正常组明显升高（P＜0.01），俞氏灌肠方各剂量组其表达较模型组明显减少（P＜0.01），说明俞氏灌肠方可通过抑制DOR、β-arrestin1和Bcl-2蛋白的表达，促进CD4+T细胞的凋亡。另一方面，目前研究已证实NF-κB在UC肠黏膜炎性细胞活化过程中具有核心地位，抑制其表达及活化是治疗的重要策略。β-arrestin2可通过结合IκBα和IKK，抑制CK2和IKK对IκBα的磷酸化，减弱NF-κB的活化，从而减轻肠黏膜炎症反应[4]。本研究结果显示：与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜组织NF-κB表达明显升高，β-arrestin2表达明显下降（P＜0.01）；与模型组比较，俞氏灌肠方各剂量组NF-κB表达明显下降（P＜0.01），复方中、高剂量组β-arrestin2蛋白表达明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。该结果说明俞氏灌肠方可通过上调β-arrestin2蛋白的表达抑制NF-κB的表达和活化，从而减轻了肠道炎症反应。综上所述，俞氏灌肠方治疗溃疡性结肠炎的作用机制可能是通过影响β-arrestin的相关信号通路蛋白的表达促进CD4+T细胞的凋亡并抑制NF-κB的表达、活化，从而减轻了肠道炎症反应对结肠的损伤，有助于恢复肠黏膜的免疫稳态。