miR-216a调控ARID1A 在非小细胞肺癌作用及肿瘤CT 表现

陆鑫 邓舒昊 文峰 赵振国

上海市浦东新区人民医院放射科201200

肺癌是发病率病死率极高的癌症之一[1],其中NSCLC在肺癌中的占比达到80%左右[2]。尽管靶向治疗和免疫治疗有所改善,但大多数肺癌患者仍缺乏有效的治疗方法,因此研究肺癌的发病机制和分子事件具有重要意义[3]。ARID1A (AT-rich interacting domain containing protein 1A)编码的BAF250a作为SWI/SNF染色质重塑复合物的一部分,是多种癌症类型中突变率最高的基因之一[4-5]。最近,ARID1A 失活突变已在多种癌症中被发现,这表明它在许多不同类型的细胞中也具有抑癌作用。Karachaliou 等[6]发 现 通 过185 例 肺 腺 癌cf DNA 样本的基因组分析显示,12%的患者中存在ARID1A 突变,并且与致癌驱动因子共发生。Jiang等[7]已证实ARID1A、CDH10、EMT 相关基因突变与宫内膜样型子宫内膜癌患者肺转移相关。微小RNA (miRNAs)是非编码RNA 家族的一员,长度约为18～25个核苷酸,已经证明,越来越多的miRNA 在肺细胞癌变的过程中发挥作用,Wang 等[8]研 究 证 明miRNA-101 通 过 靶 向DNMT3A,影响PTEN/AKT 信号通路从而抑制肺癌的进展。Zeng等[9]前期研究发现miRNA-205在NSCLC 中靶向SMAD4,促进肺癌细胞生长。但miR-216a在NSCLC 中的作用尚不清楚。本研究旨在观察miR-216a和ARID1A 对NSCLC 细胞增殖、周期和迁移能力的影响,明确miR-216a是否直接靶向作用于ARID1A,揭示miR-216a 在NSCLC中的作用及其发病机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 前瞻性研究。收集2017年3月至2020年3月上海市浦东新区人民医院NSCLC手术且血浆miR-26a异常表达患者126例,根据2009年国际肺癌协会最新分期标准,126 例患者均为T1N1期,病理类型均为鳞癌。所有患者术前均未进行化学治疗,所有新鲜标本离体后,均迅速液氮冷冻保存,并经术后病理确诊。所有患者均知情同意并签暑知情同意书,本研究已通过上海市浦东新区人民医院伦理委员会审查批准(2020-LS-ky015)。

1.2 CT 检查 采用64排螺旋CT 进行扫描,层厚0.625 mm、电压120 k V、自动电流,扫描范围从肺底到肺尖,经肘静脉注射非离子型碘海醇造影剂后,单次屏气并完成扫描,扫描时间9～10 s、造影剂注射流率2.5 ml/s。得到CT 图像后进行重建,于肺窗测量病灶的轴位最大长径、与其垂直的最大短径以及冠状位最大垂直长径。

1.3 细胞培养和转染 A549细胞株用含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养。待A549细胞生长至70%～90%融合时,将A549 细胞株分为对照(NC)组,miR-216模拟物组,miR-216模拟物+ARID1A 组,以 上3 组 按 (Lipofectamine TM 2000)试剂说明书进行转染。

1.4 qRT-PCR 检测 使用Trizol从细胞或血浆中提取总RNA,紫外分光光度法测定RNA 的含量,采用逆转录试剂盒将提取的总RNA 合成cDNA,按照qRT-PCR 试剂盒说明书进行PCR 反应,miR-216a的表达水平以U6为内参,ARID1A的mRNA 表达水平以GAPDH 为内参,qRT-PCR结果以2-ΔΔCT值形式得到。

1.5 CCK-8实验 对数生长期的A549细胞用胰酶消化并吹打均匀制成单细胞悬液,以2 000个细胞/孔的量接种细胞到96孔板,每孔200μl细胞悬液。细胞在转染72 h后,按照CCK-8试剂盒操作说明书于每孔加入CCK-8溶液10μl,于37℃培养箱中孵育1 h,在450 nm 波长下测定吸光度。

1.6 Transwell迁移实验 A549细胞转染后细胞悬液以密度为1×106个/ml接种于上室,在下室加入完全培养液,24 h后,取出小室后用PBS缓冲液冲洗3次,将小室用95%乙醇中固定10 min。结晶紫染色液染色,24 h 后用无菌棉签轻拭去上层细胞,在显微镜下观察下层迁移细胞染色计数。

1.7 双荧光素酶报告基因实验 通过TargetScan发现miR-216a与ARID1A 基因3'-UTR 的潜在结合位点,构建ARID1A 野生型3'-UTR 荧光素酶报告基因质粒p MIR-ARID1A-wt和突变型报告基因质粒p MIR-ARID1A-Mut,将野生型或突变型报告基因质粒与miR-NC,miR-216a模拟物共转染进A549细胞。转染24 h后,利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组的荧光素酶活性。

1.8 Western Blot实验 采用RIPA 裂解缓冲液提取细胞或组织蛋白,BCA 法检测蛋白浓度,取上样缓冲液与样品混合并置于95 ℃变性10 min。蛋白样品以每孔50μg加到10%SDS-PAGE 中电泳分离蛋白,将蛋白转到PVDF膜上后,5%脱脂奶粉封闭2 h。将ARID1A 抗体 (1∶500),βactin抗体 (1∶1 000)加入至PVDF 膜,β-actin为内参。4℃过夜。弃一抗,加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记二抗,室温孵育1h,弃二抗。ECL化学发光剂显色,暗室下显影。

1.9 免疫荧光实验 将组织切片脱蜡入水,微波加热法修复抗原,温度94 ℃左右,10～15 min,自然冷却至室温。加入5%的正常羊血清封闭,37 ℃孵育60 min。弃去血清,滴加ARID1A 抗体(1∶500),Ki67抗体 (1∶1 000),4 ℃过夜。弃一抗,滴加荧光素标记的二抗,37 ℃避光孵育60 min。弃二抗,防淬灭封片剂封片,4 ℃避光保存。荧光显微镜观察拍照。

1.10 流式细胞法 将对数生长期的A549细胞收集于5 ml 离心管中,用0.01% 胰蛋白酶消化30 min。用普通离心机100×g离心5 min后弃上清,再用预冷的PBS洗涤1次,100×g离心5 min后弃上清,收集细胞于同一5 ml流式离心管中,然后用4 ℃预冷的70%乙醇固定细胞1 h。去除乙醇后用PBS 洗涤1 次,用细胞染色液重悬细胞,并调整细胞密度为1×106个/ml,最后用流式细胞仪检测细胞周期。

1.11 建立肺癌裸鼠移植瘤模型 选取BALB/c裸鼠8只,5～7周,体重16～20 g,所有裸鼠随机分为NC裸鼠组(n=4)和miR-216a模拟物裸鼠组(n=4)。A549细胞转染后,调整细胞浓度达到5×107个/ml,用1 ml注射器将细胞悬液注射到裸鼠的右后肢腋部皮下,裸鼠接种细胞数为1×107个/只。注射后的裸鼠置于SPF级动物实验室饲养,每3 d用游标卡尺测量每只裸鼠移植瘤的最大直径a和最小径b,21 d后处死裸鼠,从皮下去除其肿瘤组织并称重及甲醛固定。

1.12 统计学分析 应用SPSS 22.0软件进行统计学分析,正态分布的计量资料以±s表示,2组均数比较采用独立样本t检验,多组均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC 患者肺部病灶CT 测量指标 qRTPCR检测NSCLC 患者血浆miR-216a的表达,按照血浆miR-216a 水平将NSCLC 患者分为miR-216a高表达和低表达2组,观察2组患者病灶的CT 测量指标:结果显示,血浆miR-216a高表达患者肺部病灶的轴位最大长径、与轴位最大长径垂直的最大短径和冠状位最大垂直长径均大于血浆miR-216a低表达患者(P值均<0.05),见表1。

表1 血浆中miR-216a高表达和低表达NSCLC患者病灶CT 测量值比较 (±s,cm)

表1 血浆中miR-216a高表达和低表达NSCLC患者病灶CT 测量值比较 (±s,cm)

组别 例数 轴位最大长径 与轴位最大长径垂直的最大短径 冠状位最大垂直长径miR-216a高表达 97 3.83±0.59 2.38±0.41 4.13±0.72 miR-216a低表达 29 2.31±0.45 1.69±0.34 2.41±0.48 t值 8.324 8.248 12.070 P 值 <0.01 <0.01 <0.01

2.2 ARID1A 在NSCLC 组织中的表达 采用Western blot及免疫荧光检测ARID1A 在NSCLC组织和癌旁组织中的表达水平,结果显示,ARID1A 蛋白在NSCLC的表达水平明显低于癌旁组织(1.01±0.12比0.37±0.03,t=58.079,P<0.001) (图1)。同时,相比癌旁组织,ARID1A在NSCLC组织的表达明显降低 (1.01±0.11比0.32±0.02,t=69.275,P<0.01)(图2)。

图1 Western blot检测ARID1A 在NSCLC组织和癌旁组织中的表达水平 A:电泳图;B:柱状图

图2 免疫荧光检测ARID1A 在NSCLC 组织和癌旁组织中的表达水平 Scale bar=50μm ×200 A:癌旁组织;B为癌组织

2.3 miR-216a靶向调控ARID1A 的表达 采用TargetScan筛选miR-216a 的潜在靶基因显示,ARID1A 的3'-UTR 上具有潜在的结合位点与miR-216a形成互补(图3)。双荧光素酶报告基因证实,当miR-216a 模拟物与p MIR-ARID1A-wt质粒共转染进A549细胞时,荧光素酶活性明显降低(34.68±3.27比26.12±1.94,t=3.899,P=0.018),当miR-216a 模拟物与p MIR-ARID1AMut质粒共转染时,荧光素酶活性均无明显变化(35.62±3.31比32.81±2.97,P>0.05)。进一步上调miR-216a的表达后,ARID1Am RNA 表达明显减低(1.02±0.09比0.61±0.05,t=6.897,P=0.020) (图4),Western blot显示ARID1A 蛋白的表达较对照组均明显降低 (1.00±0.08比0.57±0.04,t=8.327,P=0.01)(图5)。

图3 ARID1A 的3'-UTR 上具有潜在的结合位点与miR-216a形成互补

图4 当miR-216a 模拟物与p MIR-ARID1A-wt及p MIRARID1A-Mut质粒共转染进A549细胞时荧光素酶活性变化

图5 上调miR-216a的表达后ARID1A 的表达变化A:qRT-PCR 检测;B:Western blot检测

2.4 miR-216a对A549细胞增殖和迁移的影响qRT-PCR 检测显示,miR-216a 模拟物转染进A549细胞后,细胞中miR-216a 的表达量升高(1.03±0.14比4.51±0.42,t=13.615,P<0.01,图6),表明转染成功。采用Transwell检测转染miR-216a模拟物组迁移细胞计数均明显高于NC组(33.21±3.45比66.12±5.84,t=8.404,P<0.01)(图7)。

图6 qRT-PCR 检测miR-216a模拟物转染进A549细胞后细胞中miR-216a的表达量升高

图7 Tranwell检测转染miR-216a模拟物组A549细胞迁移细胞计数均明显高于NC组(结晶紫染色,Scale bar=50μm,×400)a P <0.01 A:NC组;B为miR-216a模拟物组;C:柱状图

2.5 miR-216a和ARID1A 对A549细胞细胞生物学行为影响 CCK-8法显示,单独上调miR-216a的表达能促进A549 细胞的增殖能力,而共转染miR-216a模拟物和ARID1A 细胞的增殖能力明显低于转染miR-216a模拟物细胞 (图8)。采用流式细胞法检测各组细胞的S期比值,结果显示,转染miR-216a模拟物组细胞的S 期比值明显高于NC组,但共同过表达miR-216a 模拟物和ARID1A后,S期细胞比值明显降低 (图9)。Transwell检测显示,上调ARID1A 的表达能逆转miR-216a对细胞迁移的促进作用(图10)。见表2。

表2 miR-216a和ARID1A 对A549细胞细胞生物学行为影响 (±s)

表2 miR-216a和ARID1A 对A549细胞细胞生物学行为影响 (±s)

注:与NC组比较,a P <0.01;与miR-216a模拟物组比较,b P <0.01

组别 例数 增殖能力 (A 值) S期细胞 (%) 迁移细胞计数 (个)NC组 3 1.76±0.18 16.84±1.94 44.89±4.59 miR-216a模拟物组 3 2.52±0.24a 26.43±2.57a 80.23±7.52a miR-216a模拟物+ARID1A 组 3 1.37±0.14b 12.75±1.93b 33.96±3.87b F 值 28.087 31.487 66.460 P 值 0.000 0.000 0.000

图8 CCK-8法检测各组细胞增殖能力

图9 流式细胞法检测各组细胞的S期比值

图10 上调ARID1A 的表达能逆转miR-216a对细胞迁移的促进作用 (结晶紫染色,Scale bar=50μm,×400) A:NC 组;B为miR-216a模拟物组;C:miR-216a模拟物+ARID1A 组;D:柱状图

2.6 miR-216a在肺癌裸鼠移植瘤模型中的作用将转染miR-216a模拟物及阴性对照的A549细胞接种于裸鼠皮下构建肺癌裸鼠移植瘤模型,21 d后剥离瘤体并称重,发现miR-216a模拟物裸鼠组的瘤体体积和重量均明显升高 (图11、12)。采用免疫荧光检测裸鼠瘤体中Ki67的表达水平,结果显示,miR-216a模拟物裸鼠组Ki67的表达明显高于NC裸鼠组(图13)。见表3。

图11 miR-216a对肺癌裸鼠移植瘤体体积的影响

图12 miR-216a对肺癌裸鼠移植瘤体重量的影响

图13 免疫荧光检测肺癌裸鼠瘤体中Ki67 的表达水平 A:NC裸鼠组;B:miR-216a模拟物裸鼠组 Scale bar=50μm,×200

表3 过表达miR-126a在肺癌裸鼠移植瘤模型中的影响 (±s)

表3 过表达miR-126a在肺癌裸鼠移植瘤模型中的影响 (±s)

组别 动物数 肿瘤体积 (mm3) 肿瘤重量 (g) Ki67 NC裸鼠组 4 587.14±43.12 0.28±0.02 1.00±0.08 miR-216a模拟物裸鼠组 4 1 175.76±98.42 0.57±0.06 2.32±0.23 t值 9.488 7.942 9.389 P 值 <0.01 <0.01 <0.01

2.7 miR-216a 在肺癌裸鼠移植瘤模型中对ARID1A 表达的影响 采用免疫荧光检测2组裸鼠瘤体组织中ARID1A 的表达,结果显示,miR-216a模拟物裸鼠组ARID1A 的表达明显低于NC裸鼠组(0.23±0.03比1.00±0.09,t=14.058,P<0.01)(图14)。Western blot结果显示在裸鼠瘤体组织中miR-216a 能负性调控ARID1A 的表达(0.31±0.04比1.01±0.12,t=9.585,P=0.01)(图15)。

图14 免疫荧光检测miR-216a在肺癌裸鼠移植瘤模型中对ARID1A 表达 A:NC 裸鼠组;B:miR-216a模拟物裸鼠组 Scale bar=50μm,×200

图15 Western blot检测miR-216a在肺癌裸鼠移植瘤模型中对ARID1A 表达 A:电泳图;B:柱状图

3 讨论

现已发现在多种肿瘤中,不同的miRNA 具有不同功能,可能为癌基因,也可能为抑癌因子。越来越多的miRNAs被报道在NSCLC的发生发展中起着重要作用。有研究显示,miRNA-497-5p通过调控FGF2 抑制NSCLC 的增殖和侵袭[10]。Li等[11]发现在NSCLC 中,miRNA-1908-5p 通过靶向PP5抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。虽然当前已报道了多种miRNA 在NSCLC 中表达异常并参与其病理过程,但miR-216a在该病中的作用尚鲜有报道。MiR-216a现阶段已经发现与胰腺癌[12]、肾细胞癌[13]、卵巢癌[14]的进展相关。本研究分析了NSCLC患者血浆中miR-216a异常表达的患者肺部病灶的CT 测量指标,结果显示,血浆中miR-216a高表达患者肺部病灶的轴位最大长径、与轴位最大长径垂直的最大短径和冠状位最大垂直长径均大于血浆中miR-216a 低表达患者肺部病灶,本研究结果显示miR-216a的异常表达可能与NSCLC有关。

ARID1A 基因在肿瘤组织中经常缺失,研究发现ARID1A 缺失可导致细胞周期不能正常阻滞,并证实ARID1A 具有抑制肿瘤的功能。Ashizawa等[15]报道未分化胃癌中,ARID1A 的阴性表达与整体生存率差有关。与以往研究结果类似,本研究发现,ARID1A 在NSCLC组织表达降低,提示其异常低表达可能和NSCLC存在关联。

miRNA 通过调控靶基因进而发挥生物学功能,因此,研究miRNA 功能及工作机制的关键环节是确定其靶基因[16]。 本研究首先通过TargetScan发现miR-216a在ARID1A 的3'-UTR上具有潜在的结合位点,提示ARID1A 可能是miR-216a的靶基因。本研究进一步采用双荧光素酶报告基因试验对上述预测进行验证,观察到高表达miR-216a能抑制ARID1A 野生型3'-UTR 报告基因质粒的荧光素酶活性,但是miR-216a的表达升高对突变型报告基因质粒的荧光素酶活性均无明显影响。另外,本研究还观察到在A549细胞中转染miR-216a模拟物能抑制ARID1A 的m RNA 和蛋白表达,表明ARID1A 是miR-216a的靶基因并受其负性调控。

随后本研究通过体外实验分析miR-216a 和ARID1A 是如何调控NSCLC细胞生物学行为,本实验结果显示上调miR-216a的表达后,细胞的增殖和迁移能力均明显升高,提示miR-216a可能作为促癌因子参与对NSCLC 的调节,而共转染miR-216a模拟物和ARID1A 后,miR-216a模拟物促进效果会被ARID1A 逆转,说明miR-216a是通过抑制ARID1A 的表达从而对NSCLC细胞进行调控。本研究进一步利用肺癌裸鼠移植瘤模型研究miR-216a的作用,结果显示miR-216a高表达能抑制瘤体组织中ARID1A 的表达并促进瘤体的生长,与体外结论一致,进一步证实了miR-216a具有促癌的作用。

综上所述,本研究实验结果表明miR-216a能通过靶向调控ARID1A 的表达促进NSCLC细胞的增殖,S期阻滞和迁移能力,并且在动物模型中能促进瘤体的生长,提示miR-216a可能在NSCLC中具有促癌的作用。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突