BALF病原学宏基因组二代测序应用于异常肺部影像诊断

任明霞 潘蕾 李建

空军特色医学中心呼吸与危重症医学科,北京100142

近年来,由于糖皮质激素的应用、恶性肿瘤的放化疗、骨髓移植等致使宿主免疫功能受损,导致了感染性肺部疾病的增多,且大多为疑难、重症的肺部感染,早期明确病原体,及时使用敏感药物治疗,对改善预后、减少耐药及药物不良反应非常重要[1]。而非感染性肺部疾病在症状上可有发热、咳嗽、咳痰、咯血等呼吸道症状,肺部影像异常,与感染性肺部疾病较难区分,导致了抗生素滥用、疾病的误诊。传统的病原微生物检测方法耗时长、阳性率低,对于未知或者罕见的病原微生物,无法快速识别,且大多数病原体不可培养,存在局限性[2-4]。宏基因组二代测序 (metagenomic nextgeneration sequencing,m NGS)是一种新的非培养检测方法,其检测速度更快,理论上能检测所有已知病原体,包括细菌、真菌、分枝杆菌、病毒、寄生虫等,可早期、快速、精准鉴定危重及疑难感染性疾病的病原学诊断,对于排除肺部感染也有一定的作用。目前可检测的标本种类很多,有静脉血、脑 脊 液、 痰 液、 支 气 管 肺 泡 灌 洗 液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、其他无菌体液、咽拭子、实体组织等,本研究探讨该技术检测BALF在异常肺部影像诊断中的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性研究。收集空军特色医学中心2018年9月至2020年11月各科住院行支气管镜检查患者的病例资料,其BALF 标本均行m NGS检测及常规检测病原方法的患者58例。主要住院科室:血液科30例(51.7%)、呼吸与危重症学科26例(44.8%)、皮肤科2例(3.5%)。

1.2 纳入标准 (1)住院患者;(2)年龄不限;(3)临床资料完整;(4)发热和/或伴有其他 (咳嗽、咳痰、咯血等)呼吸道症状、病因不明[1]。(5)肺部影像异常,包括斑片影、实变影、空洞影、磨玻璃影。(6)行电子支气管镜检查前常规抗感染治疗但效果不佳者;(7)经监护人或患者知情同意并签署知情同意书。本研究经空军特色医学中心伦理委员会批准空特(科研第2021-110-PJ01)。

1.3 诊断标准 感染与非感染性肺部疾病均符合纳入标准的(4)、(5),感染性肺部疾病诊断标准:(1)经培养、涂片镜检、免疫学方法、PCR、m NGS检测等,明确病原学,且针对性抗感染治疗病情好转,影像吸收。(2)未明确病原学,临床病史及实验室检验、辅助检查不支持非感染性疾病,经验性抗感染治疗后,病情好转,影像吸收。非感染性肺部疾病诊断标准:(1)经上述多种检测方法未查到病原学,经实验室检验、辅助检查确诊自身免疫性疾病或肿瘤,或有明确的用药史,且排除了合并感染及继发感染(抗感染无效,经针对病因治疗,病情好转)。(2)查到病原学,但结合临床病史不考虑致病菌、或针对病原学治疗无效。

1.3.1 方法 58例行电子支气管镜检查的患者,行支气管肺泡灌洗后收集BALF 标本,并立即送空军特色医学中心微生物室,按常规方法进行检测(普通细菌及真菌培养、涂片抗酸染色、Grocntt六胺银染色、吉姆萨染色、病毒核酸检测)病原微生物,同时BALF标本外送基因测序公司 (金匙)行m NGS法检测细菌、真菌、结核、病毒等。制定统一调查表,对58 例患者临床及微生物、m NGS的资料进行分析。

1.3.2 m NGS 法检测步骤 (1)核酸提取:将BALF经生物酶和物理方法破壁离心后,取600μl上清,并使用DNA/RNA 提取试剂盒 (1901,Genskey,天津)提取DNA/RNA,提取好的DNA/RNA 经超声破碎至200～300 bp 大小的片段。(2)文库构建和测序:使用NGS建库试剂盒(1906,Genskey,天津)进行DNA/RNA 末端修复、接头连接和PCR 扩增。扩增之后的文库,用Agilent2100 生物分析仪 (Agilent Technologies,Santa Clara,美国)对文库及插入片段大小进行质控,使用荧光定量PCR 测定遗传物浓度。构建好的文库经过Pooling 之后,使用ILLumina Next Seq550测序仪进行上机测序,测序模式为SE75,测序数据量不能低于20M reads。(3)生物信息学分析:过滤掉低质量、低复杂度以及长度<70 bp的序列,去除人的参考基因组序列,所得到的高质量测序数据与微生物基因组数据库进行比对,从而对微生物进行鉴定。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析,正态分布计量资料数据以±s表示,2组间比较采用独立样本的t检验,非正态分布数据以中位数 (Q1,Q3) 表示,组间比较采用Wilcoxon秩和检验,计数资料以例数 (%)表示,组间比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。对两种检测方法的评价采用四格表诊断性试验分析。

2 结果

2.1 感染组与非感染组临床特点、实验室指标比较 58例患者中男41例,女17例,年龄范围为10～74岁,平均(45.1±19.1)岁。按纳入标准,58例患者最终确诊为感染性肺部疾病 (感染组)42例,非感染性肺部疾病 (非感染组)16 例。2组在基础疾病(恶性肿瘤、糖尿病、血液疾病及骨髓移植、皮肤病、自身免疫性疾病)、发热、呼吸道症状 (咳嗽、咳痰、咯血),肺部可闻及啰音、血化验感染指标(血白细胞、中性粒细胞百分比、C反应蛋白、降钙素原)指标上差异均无统计学意义,BALF 中性粒细胞百分比 (参考范围0～2%),感染组明显高于非感染组 (P<0.05)。见表1。

表1 感染组与非感染组临床特点、实验室指标比较

2.2 感染组BALF 检测结果 感染组42例患者中m NGS检测阳性37 例 (88.1%),病原微生物构成比:普通细菌16例(43.2%);结核分枝杆菌2例 (5.4%);真菌17 例 (46.0%);病毒2 例(5.4%),常规检测方法检测出阳性4 例(19.5%),与m NGS 法一致,肺炎链球菌1 例、肺炎克雷伯杆菌1例、铜绿假单胞菌1例、肺孢子菌1例。1例BALF 标本m NGS检测为新型隐球菌,BALF标本经常规方法检测未检出,但最终血培养证实为新型隐球菌。见表2。

表2 感染组BALF行m NGS法检测阳性的4类病原

2.3 非感染组BALF 检测结果 非感染组16例中BALF 行 m NGS 法 检 测 结 果 阳 性10 例(62.5%),其检出的病原微生物分别为:危害罗尔斯顿菌3 例、人类疱疹病毒3 例、发酵乳杆菌2例、肺炎克雷伯菌1例、放线菌1例,检测结果阴性6例(37.5%)。常规检测方法检测结果为铜绿假单胞菌(6.3%),但最终未培养出病原菌,检测结果阴性15例(93.7%)。

2.4 2种方法检测时间和病原微生物检出率比较m NGS法内部实验全流程为21 h,但需要有标本运输及报告解读时间,检测天数一般为2 d,平均(2.00±0.01)d,常规检测出阳性结果为3～4 d,平均(3.25±0.50)d,BALF行m NGS检测天数少于常规检测,差异有统计学意义(t=5.000,P=0.002)。m NGS 法病原微生物检出率为81.0%(47/58),常规方法病原微生物检出率为8.6% (5/58),2种方法病原微生物检出率比较,差异有统计学意义(χ2=61.486,P<0.001)。

2.5 最终临床诊断和转归 42例最终诊断为感染性疾病,其中普通细菌感染19例 (3例未检出病原学),结核分枝杆菌感染3例 (1例未检出病原学),真菌感染17例,病毒感染3例 (1例未检出病原学);16例最终诊断为非感染性疾病,其中肺部恶性肿瘤5 例、药物性肺损伤 (图1A、B)3例、骨髓移植后肺排异3例、自身免疫性疾病(图1C)4例(25.0%)、白血病肺累及1例。58例患者经针对性治疗后转归:好转49例(84.5%),病情加重4例(6.9%),死亡5例(8.6%),好转率较高。

图1 肺部CT 图 A:诊断为药物性肺损伤,既往银屑病,口服阿维A 胶囊20年,就诊时为咳嗽、咳痰、发热3周。B:诊断为药物性肺损伤,因小细胞肺癌使用度伐利尤单抗2疗程,有咳嗽、咳痰,支气管黏膜活检阴性。C:诊断为抗合成酶抗体综合征,既往体建,咳嗽、咳黄脓痰,无皮疹、肌无力,外院抗JO-1阴性。综合检查结果,化验皮肌炎抗体全套提示抗JO-1阳性

2.6 m NGS法与常规检测法结果比较 m NGS法较常规检测法检测病原的敏感度、准确度均高,且假阴性较低,是其优势。阴性预测值虽然不太理想,但较常规检测法高,2种方法检测病原的阳性预测值差别不大,m NGS 法较常规检测法检测病原的特异度偏低和假阳性略偏高是其局限性,m NGS法较常规检测法检测病原的阴性预测值偏高,m NGS法检测病原阴性有一定的排除感染性疾病的诊断价值。见表3、4。

表3 最终诊断对m NGS法的评价

3 讨论

异常肺部影像,包括斑片影、实变影、空洞影、磨玻璃影等,综合临床及实验室检查,有时仍难确诊,且免疫功能异常的患者往往病情危重,且病原体复杂,需要临床医生快速给出治疗方案,国外研究报道,延迟1 h的有效抗菌及支持治疗可导致患者病死率增加5%～10%[4]。挑战临床医生的是:异常肺部影像是不是感染? 如果是感染,致病菌是什么? 如果不是感染,又是哪种非感染性疾病?

表4 最终诊断对常规检测法的评价

有基础疾病而免疫功能低下的患者,对多种病原体感染的易感性增加[5-6],本研究结果显示:感染组及非感染组在患有基础疾病、发热、呼吸道症状、肺部可闻及啰音、血感染指标异常上比较差异均无统计学意义,但是感染组BALF 中性粒细胞百分比较非感染组高,差异有统计学意义 (P<0.05),且2组BALF的中性粒细胞百分比中位数均超过正常范围,传统普通的病原学培养周期较长(3～7 d),且并非所有的病原体都能被培养出,可能还会受抗菌药物使用的影响,导致BALF 常规检测结果阴性,所以感染与非感染性疾病仍不易鉴别。本研究中1例患者,BALF 的m NGS 结果为新型隐球菌,常规微生物检测阴性,经与微生物室沟通,血标本培养时间延长,第5天报警阳性,第9天才培养出新型隐球菌。与m NGS 结果一致,尽管传统的病原微生物培养阳性为诊断金标准,但培养周期长,因此可能会延误最佳的治疗时机,且会增加患者的经济负担[2-4],而m NGS检测其优点是能够快速、客观地、同时检测临床样本中的较多病原微生物,且无需特异性扩增[7-9]。本研究显示m NGS检测天数少于常规检测(P<0.05),与文献报道相符,在临床上可以给医生提供制定治疗方案的证据及更早的治疗时间。抗菌药物的使用对m NGS检测的结果影响不明显[10],相对于传统的检测技术,m NGS敏感度更高[11],本研究结果显示:58例患者BALF 中,m NGS法较常规检测法检测病原的敏感度、准确度均高,且假阴性较低,有其明显的优势,且针对性治疗好转率较高,患者获益更多。文献[12]还提示针对非结核分枝杆菌时,BALF的敏感性高于痰标本。所以针对肺部CT 提示有病变的患者,建议首选m NGS检测的标本为BALF,不能耐受支气管镜检查的患者选择痰或血液标本。

有报道[12]m NGS检测组的存活率、预后好转率显著高于非m NGS检测组 (P=0.005)。本研究结果提示,经针对性治疗后的好转率84.5%、病死率仅8.6%,病死率与本身疾病进展有关。所以能够早期、快速、明确诊断才能为临床提供精准治疗而提高患者的生存率。多项研究[11,13-15]发现,不同人群中m NGS方法检测在病原体诊断上具有重要的参考价值:(1)免疫抑制宿主的感染,病毒和细菌诊断阳性率高于传统方法3倍以上。(2)重症脓毒症患者,其病原微生物的诊断阳性率高。(3)社区获得性肺炎中,其敏感度显著高于常规培养法和烟曲霉特异性抗体IgG 检测。(4)肺移植受者,其病毒病原体方面补充了常规诊断。本研究数据显示:感染组的BALF 的m NGS方法检测结果阳性的病原菌,主要为细菌和真菌,其次为病毒,考虑检测出的病原菌构成比例与患者所患的基础疾病有关。

尽管m NGS检测方法检出率高,但本研究中仍有临床考虑感染性肺部疾病5例患者,其BALF检测结果为阴性,分析阴性结果可能原因:(1)对于罕见病原体、胞内菌等,可能因检岀序列数少、微生物丰度低,在报告中未能列举。所以有时追溯原始数据库进行查询是必要的。 (2)长期保存BALF,而RNA 易被相关酶降解,检测要求条件较高,可能存在标本收集及运输不符合要求的情况。临床考虑非肺部感染4例,图1A～C 患者均有呼吸道症状,肺部CT 提示:实变影、斑片及渗出影、空洞影,与感染影像不易鉴别。BALF培养及m NGS方法检测均阴性,且强有力的广谱抗生素治疗无效,非感染的证据较充分,结合临床资料最终明确诊断,且对因治疗效果均良好。对于异常肺部影像,除外上述阴性可能原因外,BALF 的m NGS检测阴性可有一定的排除肺部感染性疾病的价值,故m NGS方法比传统方法具有更高的阴性预测值[16]。

m NGS仍存在一定局限性, (1)m NGS对结核、真菌等厚壁微生物检出率不太理想,但随着破壁技术的加强,这一弱点将被克服。 (2)m NGS对BALF 的要求,不能是脓性、血性,人源序列背景高,会影响病原微生物的检出率。(3)本研究结果提示m NGS法特异度低、假阳性略偏高。对于m NGS法检出的病原体性质分为致病性、可能致病性及非致病性[17]。在阅读m NGS检测的报告时,要结合微生物背景、患者的临床特征、传统的病原体检测报告和实验室检查及肺部影像学等结果综合分析[11、18]。本研究提示最终诊断为非感染性疾病的16例,但BALF 的m NGS 检测阳性的11例(68.8%),考虑为非致病性。对于m NGS检测的报告,不能盲目的因其阳性的结果及检出序列数的高低即做出诊断,需由临床医生结合所有资料做岀判断,才更能体现m NGS检测的价值。 (4)目前使用m NGS 进行药敏检测还存在一定的困难,对于检测出有意义的病原菌不能行药敏试验,仍需临床医生针对病原菌经验性制定治疗方案。

综上所述,异常肺部影像的患者,病原学诊断困难或难以鉴别感染与非感染性疾病时,选择BALF行m NGS检测,可提供快速精准的诊断依据,从而精准治疗,避免盲目使用抗生素。目前m NGS检测仍有一定局限性,需进一步完善,使患者获益更多。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突