不同贮藏年限沙葱种子萌发及呼吸生理的变化

杨忠仁，郭 霏，张 东，宋晓青，宋煜静，秦 怡，张凤兰，郝丽珍

(1内蒙古农业大学 园艺与植物保护学院，内蒙古野生特有蔬菜种质资源与种质创新重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010019；2内蒙古自治区农牧业大数据研究与应用重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018)

种子萌发是植物开始生长的先决条件，也是长期保存植物种质资源的重要前提。然而，即使在最佳条件下长期储存，种子活力也不可避免地会持续下降，直至死亡。因此，种子老化是一个累积的和不可逆转的生物氧化过程，可导致幼苗出苗延迟或不出苗，对农业生产和种质资源更新均有严重影响[1-2]。大量研究发现，膜完整性丧失[3-4]、酶降解[5]、呼吸减弱[6]和遗传物质降解[7-8]等是种子发生老化的主要生理表现。其中，呼吸强度是反映种子代谢活动水平的重要指标。种子在保存过程中呼吸逐渐减弱，发芽率随之降低[6]，且在发芽力丧失之前，种子表现出复杂的呼吸模式[9]。研究发现，种子经老化处理后，与呼吸作用有关的线粒体标志酶细胞色素C氧化酶和苹果酸脱氢酶活性降低[6]，线粒体电子传递链的还原性提高，线粒体的呼吸控制比降低，氧化磷酸化进程受到抑制[10]，使三磷酸腺苷(ATP)合成底物供应不足，导致种子活力开始下降，并最终丧失萌发的能力。

沙葱(AlliummongolicumRegel.) 又名蒙古韭、胡穆利(蒙语)[11]，属百合科(Liliaceae)葱属(AlliumLiliaceae.)多年生草本植物[12]。有研究指出，其种子使用寿命长达2～4年[13]，按种子寿命长短将其分为中等寿命类种子，这与以往“葱属植物为短命种子”[14]的定论有分歧。沙葱种子与其他葱属植物种子的差异受到众多研究者的重视。杨忠仁等[15-16]研究发现，沙葱种子采收适宜时间为花后35～40 d，在种子萌发过程中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸之间相互转化。王晓娟等[17]研究发现，沙葱种皮障碍是造成种子休眠的原因之一。常海文等[18]研究发现，沙葱种子在贮藏陈化过程中萌发能力与抗氧化酶活性呈显著正相关。但有关沙葱种子呼吸代谢相关酶的研究报道极少。沙葱是兼具蔬菜和饲草功用的蒙古高原特有种，其营养价值远超国际一级苜蓿[19]，草原羊采食沙葱后其肉品质和风味明显改善[20]，然而，野生沙葱因气候变化和放牧过度等因素破坏严重，亟待通过人工栽培驯化来合理地开发和利用，而了解其种子特性是进行人工驯化栽培的首要工作。为此，本试验以贮藏不同年限的沙葱种子为材料，测定其萌发指标、种子呼吸速率及呼吸关键酶活性，探讨贮藏过程中各指标的变化机制，以期为沙葱种质资源保存提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

贮藏1～10年的沙葱(AlliummongolicumRegel.)种子，由内蒙古农业大学内蒙古野生特有蔬菜种质资源与种质创新重点实验室提供。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 萌发指标测定 取贮藏1～10年的沙葱种子，用体积分数2%的次氯酸钠(NaClO)溶液杀菌消毒10 min，蒸馏水冲洗干净后放在铺有双层滤纸的培养皿(d=9 cm)中进行萌发试验，恒温培养箱温度为(20±1) ℃，每处理3次重复，每重复50粒种子。以胚根突破种皮为发芽标准，每隔24 h记录1次并补水，第10天结束试验，统计发芽率和发芽势，测定鲜质量(发芽或吸胀状态时的质量)以及胚根长，计算发芽指数和活力指数[21]。

发芽率=(发芽种子数/种子总数)×100%；

发芽势=(第3天发芽种子数/种子总数)×100%；

发芽指数(GI)=∑Gt/Dt；

式中：Gt为t时间内的发芽数，Dt为相应的发芽时间(d)。

活力指数(VI)=发芽指数×鲜质量。

1.2.2 生理指标测定 取贮藏1～10年的沙葱种子，用体积分数2%的次氯酸钠(NaClO)溶液杀菌消毒10 min，蒸馏水冲洗干净后于室温下吸胀6 h后进行生理指标的测定。参考Benamar等[10]的方法，采用Chlorolab 2型液相氧电极(Hansatech公司)测定种子的耗氧速率，即呼吸速率。采用植物细胞色素C氧化酶试剂盒(美国RD公司)测定酶活性。参考刘渊等[22]的方法测定酸性磷酸酶活性。采用植物异柠檬酸脱氢酶试剂盒(美国RD公司)测定异柠檬酸脱氢酶活性。参考邓秋菊等[23]的方法测定苹果酸脱氢酶活性。

1.3 数据处理

采用 Microsoft Excel软件进行数据统计与分析，用Origin 8.0 软件制图，以Duncan’s新复极差法比较处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏时间沙葱种子萌发指标的变化

种子萌发指标是衡量种子质量最基本的指标，可体现种子在某一时期的生活力和活力。由表1 可知，随贮藏时间的延长，沙葱种子萌发指标值整体表现出先上升后下降趋势，其中贮藏1～3年种子发芽率和发芽势呈升高趋势，贮藏3年后种子发芽率和发芽势达最高，显著高于贮藏4～10年种子；发芽指数和活力指数在贮藏1～2年内呈升高趋势，贮藏2年后达最高，之后整体呈逐渐下降趋势。

2.2 不同贮藏时间沙葱种子呼吸速率的变化

不同贮藏时间沙葱种子呼吸速率的变化见图1。由图1可知，沙葱种子呼吸速率随着贮藏时间的延长整体呈降低趋势，贮藏1～8年种子呼吸速率基本稳定在0.10 mg/(g·h)，其中贮藏3年种子呼吸速率显著高于其他年限种子。而贮藏9～10年沙葱种子的呼吸速率显著低于其他年限种子。

2.3 不同贮藏时间沙葱种子细胞色素C氧化酶活性的变化

细胞色素C氧化酶是线粒体内膜呼吸链上的终端酶，直接与ATP合成有关。由图2可知，沙葱种子细胞色素C氧化酶活性随着贮藏时间延长呈先上升后下降趋势，且贮藏3年时最高，之后逐渐降低，以贮藏10年时最低。

图柱上标不同小写字母表示处理间存在显著差异(P<0.05)。下图同Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P<0.05).The same below图1 不同贮藏时间沙葱种子呼吸速率的变化Fig.1 Changes of respiration rate of A.mongolia seeds at different storage times

图2 不同贮藏时间沙葱种子细胞色素C氧化酶活性的变化Fig.2 Changes of cytochrome C oxidase of A.mongolia seeds at different storage times

2.4 不同贮藏时间沙葱种子酸性磷酸酶活性的变化

酸性磷酸酶是一类存在于生物体内水解有机磷酸脂键的酶，在种子萌发过程中通过催化磷酸酯键的水解，促使其将贮存的ATP释放出来，供种子萌发所用。由图3所知，不同贮藏年限沙葱种子的酸性磷酸酶活性随着贮藏时间延长呈先升高后降低的变化趋势，且贮藏3年沙葱种子的酶活性显著高于其他年限种子，酶活性增幅也最大；贮藏10年沙葱种子酶活性最低，且显著低于其他年限种子。

2.5 不同贮藏时间沙葱种子异柠檬酸脱氢酶活性的变化

异柠檬酸脱氢酶是柠檬酸循环(TCA)中重要的限速酶，其活性变化对整个TCA循环的活跃程度有很大影响。由图4可知，沙葱种子异柠檬酸脱氢酶活性随着贮藏时间延长呈持续降低趋势。其中贮藏1年沙葱种子异柠檬酸脱氢酶活性最大，贮藏2～4年沙葱种子降幅不大，但贮藏5年后酶活性开始大幅下降。

图4 不同贮藏时间沙葱种子异柠檬酸脱氢酶活性的变化Fig.4 Changes of isocitrate dehydrogenase activity of A.mongolia seeds at different storage times

2.6 不同贮藏时间沙葱种子苹果酸脱氢酶活性的变化

苹果酸脱氢酶是TCA途径的关键酶，可以反映TCA循环的活化程度及种子的呼吸代谢强度。由图5所知，沙葱种子苹果酸脱氢酶活性随着贮藏时间延长呈先升高后降低的趋势，至贮藏10年时达到最低。其中贮藏5年沙葱种子的酶活性显著高于其他年限种子，之后大幅下降。

3 讨 论

3.1 不同贮藏时间沙葱种子活力的变化

老化是贮藏过程中影响种子质量和活力的主要因素，因此在种子贮藏过程中，保持较高水平的种子质量和活力至关重要。发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数都是反映种子生活力和活力的重要指标，也是衡量种子质量的重要指标[24]。随着长时间的贮藏，种子逐渐老化，表现为种子发芽率逐渐降低[18,25]，萌发幼苗生长受到抑制[26]。本试验结果显示，贮藏1～3年沙葱种子发芽率和发芽势呈升高趋势，3年内种子发芽率差异不显著，贮藏4～10年种子发芽率和发芽势整体显著降低；发芽指数和活力指数在贮藏1～2年内呈显著升高趋势，在贮藏3～10年呈降低趋势，表明沙葱种子在自然环境和自身生理生化指标变化等因素的共同作用下，老化程度加深，种子活力逐渐减小。这与田茜等[27]的研究结果一致。

3.2 不同贮藏时间沙葱种子呼吸生理的变化

呼吸作用是一切生活细胞所共有的生命活动，是植物新陈代谢的一个重要组成部分。在种子萌发初期，种子呼吸速率与线粒体发育、贮藏物质、生理代谢以及呼吸酶系活性等有密切关系[28]。种子老化过程中线粒体细胞色素C氧化酶活性降低，ATP合成减少[29]。本试验结果显示，种子呼吸速率和细胞色素C氧化酶活性整体变化趋势一致，在贮藏3年时最高，推测细胞色素C氧化酶活性降低造成了线粒体呼吸速率的下降。

酸性磷酸酶在生物体内催化水解有机磷酸酯键，释放出植物可以吸收利用的磷酸根离子(Pi)，而Pi是TCA循环中合成ATP的底物，因此酸性磷酸酶活性强弱间接影响TCA循环的快慢。施农农等[30]认为，酸性磷酸酶活性高低是反映水稻种子发芽力强弱的关键指标，与种子萌发后贮藏物质的代谢与转运有关。异柠檬酸脱氢酶在TCA循环中担任限速酶的角色[31]。苹果酸脱氢酶活性可以在较大程度上反映TCA循环的活化程度，催化苹果酸和草酰乙酸的相互转化。研究发现，苹果酸脱氢酶与种子萌发、细胞生长、花粉发育、糖的积累、果实发育和成熟、植物抗逆等关系密切[32-33]。本试验结果显示，沙葱种子酸性磷酸酶活性随着贮藏时间延长呈先升高后降低的变化趋势。异柠檬酸脱氢酶活性随着贮藏时间延长呈降低趋势，贮藏5年时酶活性急剧下降；而苹果酸脱氢酶活性随着贮藏时间延长呈先升高后降低趋势，贮藏5年时最高,显著高于其他年限。推测可能是由于贮藏5年后种子酸性磷酸酶和异柠檬酸脱氢酶活性降低，TCA循环中苹果酸脱氢酶活性和Pi合成受到抑制，TCA循环底物供应不足，影响了种子的正常呼吸生理。因此，在实际生产中，建议选择贮藏3年内的沙葱种子。