过表达CircBTG2对食管鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响及其分子机制

于然，肖瑶，濮娟 ，林晓露，周素芹，王维，陈皓瑜，王万鹏

1 南京医科大学康达学院附属涟水县人民医院检验科，江苏淮安223400；2 南京医科大学康达学院附属涟水县人民医院中心实验室；3 南京医科大学康达学院附属涟水县人民医院肿瘤科；4 福建医科大学附属福建省立医院消化科

食管癌（EC）好发于胸中段食管，我国食管鳞状细胞癌（ESCC）约占全部EC的70%以上。目前临床对ESCC 的治疗以手术切除为主，辅以化疗或放疗，但由于ESCC 易发生早期转移，导致患者5年生存率仅为15%左右［1-2］。ESCC 起病隐匿，同时缺乏可供早期诊断的标志物，导致ESCC 早期诊断困难。此外，ESCC具有较强的侵袭性，多数在中、晚期时被确诊的患者存在肿瘤转移，从而导致治疗失败。随着高通量基因测序技术和基因芯片技术的发展，目前已发现大量在ESCC 中异常表达的基因［3-4］。研究表明，B 细胞易位基因2（BTG2）在ESCC 细胞中表达异常，可通过调节细胞增殖、转移和细胞周期进展等生物学过程参与ESCC 的发生发展［5-6］。前期研究显示，BTG2 在ESCC 组织中低表达，且其表达与ESCC患者的临床分期显著相关；与BTG2 低表达患者相比，BTG2 高表达的ESCC 患者放疗敏感性增强、预后更好［6］。LI 等［7］研究发现，BTG2 的“副产品”环状RNA BTG2（CircBTG2）具有与 BMI-1 竞争结合 miR-330-3p 的作用，且与前列腺癌发生发展相关。但CircBTG2 在ESCC 组织及细胞中的表达变化及其对ESCC细胞生物学功能的影响目前尚不明确，为此我们进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 选择 2019 年 1 月—2020 年 4 月南京医科大学康达学院附属涟水县人民医院收治的ESCC 患者 33 例，其中男 27 例、女 6 例，术后收集其病理组织。纳入标准：①经手术治疗，且术后病理证实为ESCC；②患者入组前未接受放化疗；③患者入组前无感染病史和血液性疾病。排除标准：①临床资料不全；②无随访记录；③近期接受输血；④伴有严重感染或自身免疫性疾病。收集同期消化科内镜下取出的正常食管黏膜组织13 例份。本研究经过南京医科大学康达学院附属涟水县人民医院伦理委员会审核，受试者均签署知情同意书。

1.1.2 细胞 人ESCC 细胞系KYSE150 购自中国科学院细胞库。细胞使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基进行培养，置于含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中。本实验使用的细胞均为传代10代以内。

1.1.3 主要试剂及仪器 DMEM 培养基购自美国Gibco 公司，CCK-8试剂购自上海碧云天生物技术有限公司，TRIzol 试剂购自美国Ambion 公司。Transwell 小室购自美国Millipore 公司。CircBTG2 过表达载体pCD25-CircBTG2 和双荧光素酶报告基因载体psiCHECK2-CircBTG2 均由广州吉赛生物科技公司设计合成。miR-92b-3p模拟物及对照均购自广州锐博科技有限公司。

1.2 正常食管黏膜组织、ESCC 组织CircBTG2 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。取出－80 ℃冰箱中冻存的正常食管黏膜组织和ESCC 组织，TRIzol试剂提取总RNA。CircBTG2 引物序列：上游引物5′-ACAGCTTATGGACAAATG-3′，下 游 引 物 5′-GGAAGTGCGGGTCCACAAGACAGCG-3′；β-actin 上游引物 5′-AGGTCATCACTATTGGCAACGA-3′，下游引物 5′-CACTTCATGATGGAATTGAATGTAGTT-3′。扩增体系10 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 60 s，40 个循环。采用2－ΔΔCt法计算CircBTG2相对表达量。

1.3 CircBTG2 过表达对KYSE150 细胞生物学行为影响的观察

1.3.1 细胞分组与转染 将KYSE150 细胞以5×105/孔接种于6 孔板中，过夜培养，随机分为CircBTG2 过表达组、空载体组和对照组。每孔按照1 mL 无血清 DMEM 中加入 3 μg 质粒和 4 μL Lipo-fectamine 试剂的比例配制转染试剂。弃去6 孔板中的培养基，每孔加入1 mL 转染试剂，CircBTG2 过表达组转染CircBTG2 过表达载体、空载体组转染空白载体、对照组不进行转染。作用6 h 后弃去转染试剂，加入2 mL含10%FBS的DMEM培养基。

1.3.2 细胞转染效果观察 参照1.2 采用实时荧光定量PCR 法检测各组细胞CircBTG2 表达。结果显示，对照组、空载体组、过表达组细胞CircBTG2 相对表达量分别为 1.00 ± 0.28、1.14 ± 0.27、3.06 ±0.28，过表达组CircBTG2 相对表达量明显高于对照组和空载体组（P均＜0.01），对照组和空载体组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.3.3 细胞增殖能力观察 采用CCK-8 法。将三组细胞以1×103/孔接种于96孔板，加入100 μL培养基，置于37 ℃恒温培养箱中培养。分别于培养24、48、72、96 h 时，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，37 ℃恒温培养箱中孵育2 h。使用酶标仪测定450 nm 波长处的光密度值（OD450），以此表示细胞增殖能力。

1.3.4 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。将三组细胞以3×105/孔接种于6 孔板，每孔加入2 mL 含10% FBS 的DMEM 培养基。待细胞单层铺满6 孔板底面时，弃去培养基，用1 mL 枪头在细胞中间划一条“伤口”，PBS 清洗3 次后，重新加入培养基。培养24 h后，在倒置显微镜下观察，并拍照记录迁移距离。

1.3.5 细胞侵袭能力观察 采用细胞侵袭实验。取三组细胞，常规消化后，使用不含FBS 的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×105/mL。将100 μL 细胞悬液接种到Transwell 小室的上室中，下室加入 600 μL 不含 FBS 的 DMEM 培养液。置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h 后，小心擦去上室内未迁移的细胞，并将小室置于甲醇中固定，0.1%结晶紫溶液染色20 min。脱色后取下聚碳酯膜，封片后在显微镜下观察并拍照，记录侵袭细胞数。

1.3.6 集落形成能力观察 采用集落形成实验。将三组细胞以5×102/孔接种于6 孔板，置于37 ℃恒温培养箱中培养7～10 d。倒置显微镜下观察细胞形态，待可观察到明显的细胞团时终止培养。弃去培养基并用PBS 清洗细胞，每孔加入2 mL 无水甲醇，在4 ℃冰箱中固定细胞15 min。弃去无水甲醇并用PBS 清洗细胞，每孔加入2 mL 苏木素染色液，染色15 min后流水缓慢洗去浮色。待细胞自然干燥后拍照，记录集落形成数。

1.4 CircBTG2 与miR-92b-3p 的靶向关系分析 采用双荧光素酶报告基因实验。生物信息学预测软件starBase 显示，野生型 CircBTG2 与 miR-92b-3p 之间存在结合位点，见OSID 码图1。将KYSE150 细胞随机分为四部分，分别共转染miR-92b-3p 模拟物、对照模拟物和野生型CircBTG2、突变型CircBTG2。检测海参荧光（R值）和萤火虫荧光（F值）的信号强度，计算R/F并以此表示相对荧光强度。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常食管黏膜组织、ESCC 组织中CircBTG2 表达比较 正常食管黏膜组织、ESCC 组织中CircBTG2 相 对 表 达 量 分 别 为 4.75 ± 1.15、3.21 ±1.25，两者比较P＜0.01。

2.2 三组细胞增殖能力比较 见表1。

表1 三组细胞OD450比较（）

表1 三组细胞OD450比较（）

注：与对照组及空载体组比较，*P＜0.05，#P＜0.01。

组别过表达组空载体组对照组96 h 3.16±0.21#4.13±0.29 4.33±0.34 24 h 1.00±0.11 1.00±0.11 1.00±0.12 48 h 1.27±0.17 1.46±0.12 1.52±0.22 72 h 2.04±0.11*2.31±0.14 2.40±0.20

2.3 三组细胞迁移、侵袭、集落形成能力比较 见表2、OSID码图2。

表2 三组细胞迁移距离、侵袭细胞数、集落形成数比较（）

表2 三组细胞迁移距离、侵袭细胞数、集落形成数比较（）

注：与对照组及空载体组比较，*P＜0.05，#P＜0.01。

组别过表达组空载体组对照组集落形成数（个）21.33±2.87*31.00±2.83 33.33±2.87迁移距离（pixel）128.00±5.65#164.33±4.79 155.66±3.29侵袭细胞数（个）16.00±4.32#38.33±6.13 37.67±4.11

2.4 CircBTG2 与miR-92b-3p 的靶向作用观察结果 共转染miRNA-92b-3p 模拟物+突变型CircBTG2 的KYSE150 细胞相对荧光强度为1.00 ±0.14，共转染对照模拟物+突变型CircBTG2 的KYSE150 细胞为1.03±0.07，两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。共转染miR-92b-3p 模拟物+野生型CircBTG2的KYSE150细胞相对荧光强度为0.61±0.10，共转染对照模拟物+野生型CircBTG2 的KYSE150细胞为1.07±0.23，两者比较P＜0.05。

3 讨论

CircRNA 作为非编码RNA 的一种，已经被证实在多种恶性肿瘤中表达异常［8-9］。CircRNA大多位于细胞质中，其通过反式剪接形成闭合环状结构，不易被RNA 酶降解，在细胞中的存在较为稳定，具有成为生物标志物的潜力［10-12］。CircRNA 在体内参与各种生理和病理进程的调节，如调控基因转录、选择性剪接和 RNA 结合蛋白等［12-13］。CHEN 等［14］发现，CircNTRK2 不但与ESCC 患者的TNM 分期和预后密切相关，还可通过抑制miR-140-3p 的功能，进而促进 NRIP1 表达。人 CircBTG2 即 Hsa_Circ_0016068，定位于 chr1：203274663-203278729，由BTG2 基因第1 和第2 个外显子环化而成，是BTG2 在人体形成的惟一的CircRNA［15］。既往研究表明，在多种恶性肿瘤中均可观察到CircBTG2 异常表达，说明其可参与多种肿瘤的发生发展［7］。本研究结果显示，在ESCC组织中CircBTG2 相对表达量明显低于正常食管黏膜组织，提示CircBTG2 低表达可能参与了ESCC 的发生。本研究在对ESCC 细胞系KYSE150 进行CircBTG2过表达后发现，其在72、96 h时的细胞增殖能力明显被抑制，同时其迁移能力、侵袭能力和集落形成能力均被抑制，表明低表达的CircBTG2 可能参与了ESCC的迁移、侵袭及集落形成等恶性表型。

CircRNA 参与细胞调控的机制很多，但目前多认为CircRNA 具有大量miRNAs 结合位点，发挥抑制miRNAs 生物学作用的功能，是公认的miRNAs“海绵”［16］。本研究我们通过生物信息学预测软件starBase 发现，CircBTG2 高度结合 miR-92b-3p。近年来研究发现，miR-92b-3p在ESCC、前列腺癌、结肠癌和胃癌等多种肿瘤中发挥着促进肿瘤进展的作用［17］。本研究进一步通过双荧光素酶报告基因实验证实，CircBTG2 具有与miR-92b-3p 结合的能力。前期研究中发现，在ESCC组织中miR-92b-3p表达量明显升高，且其表达与ESCC患者的临床分期和N分期显著相关；进一步研究相关机制发现，miR-92b-3p可通过与KLF4、DSC2 mRNA结合，抑制两者蛋白表达，从而发挥促进ESCC增殖和转移的作用［17］。此外，刘飞等［18］研究指出，miR-92b 可通过调控 EZH2 基因表达，发挥抑制EC细胞增殖和侵袭的作用。上述研究结果说明，CircBTG2 可能通过结合miR-92b-3p 发挥抑制ESCC细胞增殖和转移的作用，但CircBTG2结合miR-92b-3b后的下游靶点仍需进一步研究。

综上所述，ESCC 组织中CircBTG2 表达降低，过表达CircBTG2 可通过结合miR-92b-3p 而抑制ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭和集落形成等生物学行为，提示CircBTG2具有成为ESCC 治疗靶点的潜力。同时，CircBTG2 具有闭合环状结构，使其能稳定存在于细胞质中，故CircBTG2 也具有作为ESCC 诊断标志物的潜力。