lncRNA GAS5调控Notch通路对骨髓间充质干细胞软骨分化的影响

王勇超，粟钦，林昕，田强，傅美淳，张克云

湖南医药学院第一附属医院关节运动医学科，湖南怀化418000

关节软骨缺损是一种由多种因素造成的关节透明软骨缺损，会导致关节僵硬、疼痛，加速关节退变，由于关节软骨缺乏血管及淋巴，其自我修复能力极其有限。传统骨髓刺激疗法对关节软骨缺损的治疗效果较差，目前以骨髓间充质干细胞（BMSCs）为基础的软骨组织工程已被认为是治疗软骨缺损的一种有效方法［1-2］。BMSCs 是一种具有高度分化能力的多能干细胞，可分化为软骨细胞、成骨细胞，用以修复缺损组织［3］。因此，有效促进BMSCs 软骨分化对关节软骨缺损患者的治疗极其重要。近年来，长链非编码RNA（lncRNA）在调节BMSCs 软骨分化中的作用逐渐得到关注［4］。研究发现，lncRNA 生长停滞特异性转录本5（GAS5）参与了骨关节炎等软骨损伤疾病的发生，其高表达可促进BMSCs 的成骨分化，延缓骨骼疾病进展，但目前关于其对BMSCs 软骨分化的影响鲜见报道［6］。Notch 通路在间充质干细胞（MSCs）的维持及细胞增殖过程中具有重要作用，抑制其激活可显著促进MSCs 的软骨分化［7］。研究显示，Notch 通路在关节软骨损伤患者的软骨组织中被显著激活［7］。目前关于 lncRNA GAS5 是否可能通过调控Notch 通路而影响BMSCs 软骨分化尚不明确，为此我们于 2020 年 1 月—2021 年 2 月进行了如下研究，为研究BMSCs 软骨分化的发生机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD 大鼠5 只，7 周龄，体质量200～255 g，均购自扬州大学；在明暗交替12 h/12 h 环境中适应性饲养7 d，许可证号：SCXK（苏）2017-0007。

1.1.2 主要试剂 Notch 信号通路特异性阻断剂2，4-二氨基-5-苯噻唑（DAPT，30050619）购自深圳海思安生物技术有限公司；兔抗Notch1、β-actin 抗体（3608、4970）均购自美国CST公司，兔抗Split多毛增强子1（Hes-1）、Ⅱ型胶原纤维α1（COL2a1）、蛋白聚糖（Aggrecan）抗 体 、Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）均 购 自 美 国 Abcam 公 司 ；CD90-FITC（328107）购 自 美 国 BioLegend 公 司 ，CD45-FITC（555482）购自美国BD Biosciences 公司，CD29-FITC（MCA1949F）购自美国Bio-Rad 公司；BCA 蛋白定量试剂盒、蛋白提取试剂盒（PN0120-500T、EX6110-100T）均购自定州百克赛斯生物科技有限公司，反转录试剂盒（K1622）购自武汉科昊佳生物科技有限公司，qRT-PCR 检测试剂盒（QPG-020～QPG-023）购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.1.3 主要仪器 BD FACSCANTO Ⅱ流式细胞仪（BD001）购自上海基泰生物科技有限公司，Monad（莫纳）QuickGel 6100 凝胶成像系统（IN0611）购自北京必吉生物科技有限公司，ABI Step One Plus 实时荧光定量PCR 仪购自北京希凯恩生物科技有限公司。

1.2 BMSCs的分离、培养与鉴定

1.2.1 BMSCs 的分离、培养 将5 只大鼠颈椎脱臼处死后浸入75%乙醇中10 min，移入超净工作台中分离股骨，用10 mL DMEM 培养基（低糖、10%胎牛血清）冲洗骨髓腔并收集骨髓细胞，反复吹打使骨髓细胞悬液混匀，并调整细胞密度为5×105/mL。将细胞接种于培养瓶（50 mL）中，置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养，至细胞融合度达80%时使用0.25%胰酶消化传代，在此期间每隔2 d更换一次培养液。

1.2.2 BMSCs 的鉴定 细胞培养到第3 代时，用倒置相差显微镜观察BMSCs形态；结果显示，第1代分离的细胞呈长梭形或三角形；第3 代细胞形态为均一的长梭形，且呈现旋涡状、鱼群样分布。0.25%胰酶消化第3 代BMSCs，1 000 r/min离心5 min弃去上清液，添加300 μL PBS 重悬后移入到流式管中，分别添加 5 μL CD90-FITC、CD29-FITC、CD45-FITC抗体，混匀避光孵育0.5 h，在流式细胞仪中检测BMSCs 表面标志物；结果显示，CD90 与 CD29 阳性表达率分别为98.16%、96.22%，而CD45 阳性表达率为0.89%。

1.3 细胞分组及处理方法 将第3 代BMSCs 分为对照组、p-EGFP-C1 组（转染 p-EGFP-C1 空载体质粒）、p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 组（转染p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 过表达质粒）、p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT 组（转染 p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 过表达质粒并添加 100 ng/mL DAPT）［8］；将 100 μL BMSCs 接种到 6 孔板中（5×103/mL），使用 Lipofectamine 2000 转染试剂盒进行质粒转染，置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养24 h。

1.4 细胞lncRNA GAS5 表达检测 采用qRT-PCR法。收集转染后的各组细胞，使用TRIzol 法提取细胞总RNA，检测其浓度及纯度合格，使用反转录试剂盒对其进行反转录，以所得到的cDNA 为模板进行qRT-PCR 扩增。引物序列：lncRNA GAS5 上游引物5'-CTTGCCTGGACCAGCTTAAT-3'、下游引物5'-CAAGCCGACTCTCCATACCT-3'，内参 GAPDH 上游引物5'-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3'、下游引物5'-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3'。 采 用 2－ΔΔCt法计算lncRNA GAS5相对表达量。

1.5 软骨分化诱导及鉴定

1.5.1 软骨分化诱导 将各组细胞置于成软骨诱导培养基中，培养14 d。软骨诱导培养基为包含10 mmol/L β-磷酸甘油、0.05 mmol/L 抗坏血酸、1 mmol/L丙酮酸钠、100 nmol/L地塞米松、10 ng/mL转化生长因子β（TGF-β）的 DMEM 培养基（低糖、10%胎牛血清）。

1.5.2 软骨细胞形态鉴定 采用HE 染色。将软骨诱导培养14 d 后的各组细胞进行胰酶消化，调整细胞密度为1×105/mL，滴加到6孔板中的盖玻片上。培养24 h后取出细胞爬片，经乙醇固定20 min、苏木精核染2 min、伊红复染1 min，晾干、封片，光镜下观察细胞形态及数量变化。

1.6 软骨细胞特征性分泌物COL2a1、Aggrecan 表达检测 采用免疫细胞化学法。4%多聚甲醛固定细胞爬片20 min，PBS 洗涤后使用0.1% Triton X-100 浸泡10 min，3%过氧化氢处理15 min，1%胎牛血清白蛋白封闭1 h。4 ℃加入COL2a1、Aggrecan 抗体孵育过夜，次日加入山羊抗兔IgG 二抗孵育1 h，在SABC 湿盒内孵育30 min。DAB 显色后苏木精复染，经流水中返蓝后脱水、透明、封片，显微镜观察并拍照。棕黄色为阳性染色细胞，计算阳性表达率。阳性表达率=阳性染色细胞/视野范围内细胞数×100%。

1.7 软骨细胞Notch 通路相关蛋白（Notch1、Hes-1）表达检测 采用Western blotting 法。使用RIPA 裂解液对各组细胞进行裂解，12 000 r/min 离心10 min，取上清液，BCA 试剂盒检测总蛋白浓度。行SDS-PAGE 凝胶电泳（每个泳道中添加30 μg 蛋白）分离蛋白，按照分子量大小进行切胶、转膜，封闭后添加兔抗Notch1、Hes-1、β-actin一抗（稀释比例均为1∶1 000），次日加入HRP 标记的IgG 二抗（稀释比例1∶5 000），孵育2 h。ECL 化学发光试剂显影，蛋白凝胶成像系统观察，Image J软件分析Notch1、Hes-1、β-actin 条带灰度值，计算 Notch1、Hes-1 蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞lncRNA GAS5表达比较 对照组、p-EGFP-C1 组、p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 组、p-EGFPC1-lncRNA GAS5+DAPT 组 细 胞 lncRNA GAS5 相 对表达量分别为 1.00 ± 0.12、1.01 ± 0.10、1.52 ±0.18、1.50 ± 0.19，p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 组、p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT 组 细 胞 lncRNA GAS5 相对表达量均明显高于对照组、p-EGFP-C1 组（P均＜0.05）。

2.2 各组细胞诱导软骨分化后的形态及数量观察情况比较 各组细胞均呈软骨细胞形态改变，即呈三角或多角形，细胞核为蓝紫色，细胞质和细胞外基质为红色，成团生长；p-EGFP-C1-lncRNA GAS5组与p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT 组软骨细胞数量明显多于对照组和p-EGFP-C1 组，以p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT组软骨细胞数量最多。

2.3 各组细胞COL2a1、Aggrecan 阳性表达率比较 与对照组及p-EGFP-C1 组比较，p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 组及p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT组细胞COL2a1、Aggrecan 阳性表达率均升高，且p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT组升高更明显（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞COL2a1、Aggrecan阳性表达率比较（）

表1 各组细胞COL2a1、Aggrecan阳性表达率比较（）

注：与对照组及 p-EGFP-C1 组比较，*P＜0.05；与 p-EGFP-C1-lncRNA GAS5组比较，#P＜0.05。

Aggrecan（%）6.92±0.86 7.03±1.10 43.23±8.16*65.50±9.27*#组别对照组p-EGFP-C1组p-EGFP-C1-lncRNA GAS5组p-EGFP-C1-lncRNA GAS5组+DAPT组COL2a1（%）4.20± 0.75 4.18± 1.33 49.90± 7.63*75.12±10.36*#

2.4 各组细胞Notch1、Hes-1 蛋白表达比较 与对照组及p-EGFP-C1 组比较，p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 组 及 p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT 组 细 胞Notch1、Hes-1 蛋白相对表达量均降低，且p-EGFPC1-lncRNA GAS5+DAPT 组 降 低 更 明 显（P均 ＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞Notch1、Hes-1蛋白相对表达量比较（）

表2 各组细胞Notch1、Hes-1蛋白相对表达量比较（）

注：与对照组及 p-EGFP-C1 组比较，*P＜0.05；与 p-EGFP-C1-lncRNA GAS5组比较，#P＜0.05。

Hes-1 1.05±0.10 1.06±0.17 0.63±0.06*0.30±0.04*#组别对照组p-EGFP-C1组p-EGFP-C1-lncRNA GAS5组p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT组Notch1 1.40±0.22 1.38±0.25 0.92±0.15*0.52±0.10*#

3 讨论

关节软骨作为滑膜关节重要的功能单位，具有润滑、抗磨损、吸收震动、传导载荷等作用，一旦受到损伤就会造成不可逆的病理变化，导致骨关节炎的发生，严重影响患者的日常行走及生活质量［1］。由于关节软骨中不含神经组织、淋巴、血管，使得其自我修复能力十分受限，而传统的药物治疗及关节置换术等方法虽然有效，但仍有三分之一的患者不甚满意，因此迫切需要寻找新的治疗方法［9-11］。MSCs具有自我更新及多向分化能力，目前BMSCs 已在动物模型及临床病例中被广泛研究，显示出具有通过诱导软骨分化来治疗骨关节炎的潜能［9，12］。本研究从大鼠骨髓中分离出BMSCs，经倒置显微镜观察细胞形态及表面标志物鉴定CD90、CD29呈高表达，而CD45 呈低表达，证实成功分离出BMSCs，可用于后续实验。

lncRNA 能通过与相关转录因子相互作用来参与调控干细胞的维持和分化。研究发现，lncRNA 参与了关节软骨细胞的分化过程［12-13］。研究显示，lncRNA GAS5 能够减轻骨关节炎小鼠的关节软骨破坏，并可能通过抑制核因子 κB（NF-κB）和Notch 信号通路来改善脂多糖诱导的ATDC5 软骨细胞凋亡及炎症损伤［14-15］。研究发现，lncRNA GAS5 过表达可通过抑制微小RNA-498（miR-498）表达，来促进人MSCs 成骨分化，缓解骨质疏松症［6］；此外，lncRNA GAS5 可通过抑制miR-135a-5p/叉头转录因子O1（FOXO1）通路来促进BMSCs 成骨分化［16］。本研究结果显示，lncRNA GAS5 过表达可显著增加软骨细胞特征性分泌物COL2a1、Aggrecan 表达及软骨细胞数量，提示lncRNA GAS5 能够有效促进BMSCs 的软骨分化，为软骨损伤的治疗提供了一个潜在靶点。

Notch 通路是一个相对保守的信号通路，当Notch 受体（Notch1～Notch4）与其配体相结合后，会导致蛋白水解并释放Notch 胞内结构域（NICD）。NICD 易位至细胞核能够调节Hes-1 等下游基因转录，以此参与调控胚胎发育、细胞增殖及分化。近年来有研究发现，Notch 通路不仅参与调控软骨形成，还参与了软骨细胞的成熟过程，激活该通路可抑制软骨分化［7，17］。研究显示，Notch通路下游因子Hes-1表达升高会抑制ATDC5 细胞软骨细胞标志物表达［17］，而miR-9可通过抑制Notch 信号通路而促进骨关节炎模型兔的软骨再生［18］。还有研究发现，Notch信号通路激活可显著抑制骨形态发生蛋白9（BMP-9）诱导的 MSCs 成骨及成软骨分化［8］。本研究结果显示，lncRNA GAS5过表达能显著降低Notch1、Hes-1蛋白表达，表明lncRNA GAS5 过表达能够有效抑制BMSCs 中的Notch 信号通路激活。本研究还发现，Notch 通路抑制剂能够进一步增强lncRNA GAS5 过表达对BMSCs 软骨分化的促进作用，为软骨损伤的治疗提供了新的研究方向。

综上所述，lncRNA GAS5可通过抑制Notch通路激活来促进BMSCs的软骨分化。本研究不仅为BMSCs软骨分化机制的研究提供参考，还为软骨损伤治疗提供了新的研究思路。但本研究未对该通路的下游机制进行深入探讨，是未来深入研究的方向之一。