FABP4对小鼠心室肌细胞收缩功能及钙瞬变的影响

王翠华，王炜 ，刘刚，姜璇，尹亚娟，郑明奇

1 河北医科大学第一医院康复医学科，石家庄050030；2 河北医科大学基础医学院生理教研室；3 河北医科大学第一医院心脏中心

脂肪酸结合蛋白（FABPs）是一类小分子蛋白质，相对分子质量14～15 kDa，主要参与长链脂肪酸的结合和转运［1］。目前，已经在人类中发现了至少9种FABPs 家族成员，其中脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白也称FABP4，高度表达于脂肪细胞和巨噬细胞中，在2 型糖尿病及代谢综合征的发生发展中具有关键作用［2-5］。近年来，FABP4 被认为是预测急性冠脉综合征患者预后的生物标志物［6］。动物实验也发现，FABP4缺乏可延缓冠状动脉粥样硬化性小鼠疾病的发生发展，表明FABP4参与了心血管疾病的进展［4］。心血管疾病如心衰发生时，心脏的兴奋—收缩耦联和收缩蛋白功能均出现异常［7］。钙瞬变是心肌细胞在兴奋—收缩耦联过程中细胞质钙浓度的瞬时性变化，钙瞬变的幅度大小可影响心肌细胞的收缩强度，两者呈正相关关系［8］。目前，关于FABP4在细胞水平对单个心肌细胞收缩力的影响鲜见报道。2020 年1月—12月，本研究采用钙成像技术和单细胞可视化功能检测系统观察FABP4对成年小鼠心室肌细胞收缩功能和钙瞬变的影响，为进一步研究FABP4 对小鼠心肌兴奋—收缩耦联的影响提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级 C57BL/6 小鼠 76 只，雌雄不限，12～14 周龄，由河北省实验动物中心提供。所用实验动物均符合美国国立卫生研究院颁布的《实验动物管理和使用指南》，实验方案获得河北医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂 FABP4 重组蛋白购自美国Cayman 公司，Ⅱ型胶原蛋白酶购自美国ROCHE 公司，Pluronic F-127 购自美国Nalgene 公司，其余Fluo-4 AM、Creatine、Taurine 等主要试剂均购自美国Sigma公司。

1.1.3 主要仪器 激光共聚焦显微镜购自美国Leica 公司，IonOptix 单细胞动缘检测系统购自美国IonOptix 公司，体式显微镜购自日本Olympus 公司，电刺激仪购自美国Thermo 公司，正置显微镜购自美国Leica公司等。

1.1.4 相关溶液配制 KB solution 的配制（单位均为mmol/L）：Na-β-OH-Butyric Acid 5，Na-Pyruvic Acid 5，Taurine 20，EGTA 0.5，NaOH（EGTA）1.09，Mg-SO4·7H2O 5，HEPES 5，glucose 10，KCl 90，Creatine 5，K2HPO430，用 NaOH 调整 pH 至 7.4。无钙 Tyrode's solution 的配制（单位均为mmol/L）：MgCl210，NaCl 1 373，KCl 54，NaOH 27，Glucose 100，Glucose 5，稀释 10 倍。1.8 mmol/L Ca2+Tyrode's solution 的配制：将 2 mol/L CaCl290 μL 加入到 Tyrode's solution 100 mL中，浓度为1.8 mmol/L。

1.2 小鼠心室肌细胞的急性分离 打开恒温水浴箱，将Langendorff 装置温度调整为37 ℃，用无钙Tyrode's solution逆行灌流，排空气泡，再将含有Ⅱ型胶原蛋白酶（0.4 g/L）的无钙 Tyrode's solution 倒入Langendorff 装置中，用于消化小鼠心脏。将小鼠麻醉后开胸取出心脏，迅速置于无钙Tyrode's solution中，在体式显微镜下修剪肺等多余组织，仅保留小段主动脉。将心脏的主动脉口快速悬挂于Langendorff装置上，用含有Ⅱ型胶原蛋白酶的Tyrode's solution循环灌流20～35 min，当灌流速度增快至无法计数且心脏颜色变淡、用手触之松软时结束灌流。取下心脏，放置在KB solution中，缓慢轻柔冲洗残余胶原酶液，在显微镜下去除主动脉弓、心房、心耳等组织。将仅留有左心室的心脏剪成细小碎块，用吸管轻柔吹打至单个心室肌细胞，200 目筛网过滤后，将心肌细胞悬液于室温静置约40 min。

1.3 细胞分组与处理方法 将心肌细胞悬液分为观察组和对照组，两组均加入1.8 mmol/L Ca2+Tyrode's solution，观察组在此基础上分别给予0.05、0.5、5、50 nmol/L FABP4，孵育10 min。

1.4 细胞收缩功能测量 取两组细胞，置于显微镜载物台中的浴槽内，利用IonOptix 单细胞动力检测系统测量细胞的收缩功能。给予15 V、10 ms、1 Hz电场刺激，先在10×镜下找到收缩状态达到实验要求的细胞，再调至40×镜，将细胞收缩影像传输到IonOptix 的MyoCam 照相系统并呈现在监视器上。由计算机自动实时采集并记录心肌细胞收缩幅度（ΔSL%）、收缩最大速率（Max dv/dt）及收缩最大速率时间（Time of Max dv/dt）。

1.5 细胞钙瞬变的动力学测量 采用钙成像技术。取500 μL 心肌细胞悬液，分别加入Fluo-4 AM和 Pluronic F-127 各 1 μL，充分混匀，避光静置 40 min。去除上清液，参照1.3 进行细胞分组处理，孵育10 min。取1 mL 细胞悬液，加入激光共聚焦显微镜的浴槽内，待细胞状态稳定后分别给予10 V、10 ms、1 Hz电刺激，采用线扫模方式记录钙敏感的荧光信号。选择稳定的心肌细胞记录钙瞬变，并通过Image J 软件分析钙瞬变幅度（ΔF/F0）和钙回收速率（τ）。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞收缩功能相关指标比较 与对照组比较，加入不同浓度FABP4 的观察组细胞ΔSL%均降低，以加入50 nmol/L FABP4 的观察组细胞降低最明显（P均＜0.05）；除加入 0.05 nmol/L FABP4外，其余加入不同浓度FABP4 的观察组细胞Max dv/dt 均降低（P均＜0.05）。与对照组比较，仅加入50 nmol/L FABP4 的观察组细胞Time of Max dv/dt降低（P＜0.05），加入其他浓度FABP4 的观察组细胞 Time of Max dv/dt 均无明显变化（P均＞0.05）。见表1。

表1 两组细胞收缩功能相关指标比较（-x±s）

2.2 两组细胞钙瞬变相关指标比较 与对照组比较，加入5、50 nmol/L FABP4的观察组细胞ΔF/F0均降低（P均＜0.05），加入不同浓度FABP4的观察组细胞τ均无明显变化（P均＞0.05）。见表2。

表2 两组细胞钙瞬变相关指标比较（）

表2 两组细胞钙瞬变相关指标比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别观察组0.05 nmol/L 0.5 nmol/L 5 nmol/L 50 nmol/L对照组ΔF/F0τ（F/s）0.124±0.009 0.116±0.007 0.120±0.006 0.135±0.015 0.107±0.004 1.91±0.04 1.93±0.03 1.92±0.03*1.83±0.05*2.01±0.03

3 讨论

以往研究发现，FABP4 在肥胖和代谢综合征的发病过程中发挥重要作用，缺乏FABP4 的小鼠尽管极端肥胖，却没有出现胰岛素抵抗或者糖尿病，这与FABP4 缺乏的小鼠未能在脂肪组织中表达胰岛素抵抗相关因子有关［4，9］。近年来，FABP4 在心血管系统中的作用也越来越受到关注。研究证实，给予FABP4 抑制剂后，动脉粥样硬化小鼠的动脉硬化情况较前明显改善［10-11］。在人类中，血清FABP4 水平与左心室肥厚及心脏收缩功能障碍相关［12］。在冠心病患者中，FABP4 与左心室功能障碍和心肌灌注异常呈正相关关系［13］。LIU 等［14］研究显示，心衰患者血清FABP4 水平明显升高，且这种相关性随着心衰程度加重而显著增加。有研究发现，脂肪组织或巨噬细胞分泌的外源性FABP4 可以抑制心肌细胞收缩，并通过旁分泌作用影响肥胖和代谢综合征患者的心脏功能［15］。

本研究观察的收缩功能指标ΔSL%是细胞收缩幅度占单个细胞长度的百分比，可以更有效排除因单个细胞大小不同而导致的收缩幅度不同，能更准确反映心肌细胞的收缩能力。结果表明，FABP4 不仅可以抑制小鼠心室肌细胞的收缩幅度，而且随着FABP4 浓度的升高，这种心肌细胞收缩幅度的抑制作用逐渐增强。本研究进一步分析了FABP4 对心室肌细胞 Max dv/dt 及 Time of Max dv/dt 的影响，发现FABP4 作用后的心肌细胞Max dv/dt 显著下降，即在相同时间内，收缩最大速率下降导致收缩幅度下降，表明细胞收缩功能减弱。因此，我们推测FABP4 可通过降低细胞收缩的速率而抑制心肌细胞的收缩功能。

钙瞬变是心肌细胞在收缩和舒张过程中细胞质钙离子浓度的瞬时性增高，在兴奋—收缩耦联中发挥着重要的作用。心肌去极化时，L 型钙通道（LTCC）开放，细胞外钙离子进入细胞内，激活Ⅱ型雷诺丁受体（RyR2）；RyR2 位于肌质网上，是一种钙释放通道，RyR2 被激活后大量钙离子释放入细胞质，进而引起下游机制中肌钙蛋白发生构象改变，产生肌丝滑行，细胞开始收缩。在心肌复极化时可激活肌质网钙离子泵钙ATP 酶（SERCA），SERCA 是一种钙回收蛋白质，在兴奋—收缩耦联末将Ca2+回收入肌质网中，心肌细胞进入舒张过程。从心肌细胞的收缩和舒张过程可知，RyR2 和SERCA 在心肌细胞钙瞬变过程中具有重要作用。在心力衰竭或心肌梗死时，心脏收缩能力的下降与心肌细胞Ca2+浓度改变及肌小节蛋白功能异常有关，而与LTCC 关系不大，心衰时RyR2和SERCA 功能均受到抑制，即心肌细胞ΔF/FO下降并且τ减低［16-17］。

本研究中由钙成像技术检测的钙瞬变参数τ 可代表 SERCA 活性，τ 的大小与 SERCA 活性呈负相关关系。钙瞬变幅度ΔF/F0代表小鼠心肌细胞内RyR2 活性，两者呈正相关关系。本研究结果发现，低浓度FABP4对SERCA无抑制作用，在较高浓度时对RyR2 才有抑制作用，但这种抑制与对心肌细胞收缩的抑制相比明显弱了很多，由此我们认为，FABP4 对心室肌细胞收缩能力的抑制作用几乎不依赖于钙释放的调控，说明FABP4 并非通过钙依赖性途径，可能通过其他途径抑制心肌细胞收缩。在兴奋—收缩耦联过程中，影响心肌细胞收缩功能的机制主要有上游机制（LTCC 调节机制）、中心机制（肌质网钙释放及钙回收机制）及下游机制（肌小节蛋白调节机制）。LAMOUNIER-ZEPTER 等［15］研究报道，FABP4 对心肌细胞的收缩幅度有抑制作用，但对动作电位时程和LTCC 电流无显著影响，我们的研究在此基础上进一步发现FABP4 对钙瞬变仅有较弱的抑制作用，因此推测FABP4 可能通过调节肌小节蛋白功能抑制心肌细胞收缩，为以后的深入研究提供了理论基础。

综上所述，FABP4 可通过降低细胞收缩速率而减小心肌细胞的收缩幅度，但对钙瞬变的抑制作用较弱。FABP4 是否通过调节肌小节蛋白功能而抑制心肌细胞收缩，未来需进一步探讨。